FMNL2、RhoC、PRL3在結腸癌細胞中的表達及其調(diào)控關系.pdf

1、一、研究背景以及研究目的
　　 結直腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)逐年上升趨勢。轉移是導致結直腸癌患者死亡的主要原因之一，闡明結直腸癌的分子轉移機制以及控制腫瘤轉移成為當前的主要研究方向;同時尋找結直腸癌侵襲轉移相關的生物學標記，為藥物作用靶點提供理論基礎。
　　 最近Formins家族蛋白作為細胞骨架的結構組建和裝配的關鍵調(diào)控分子引起人們的廣泛關注，F(xiàn)MNL2是最近發(fā)現(xiàn)的一個Diaphano

2、us相關的formins(DRFs)亞家族成員，在前期實驗中，我們通過基因芯片生物信息學發(fā)現(xiàn)FMNL2與結直腸癌轉移相關，可能作為一個研究結直腸癌侵襲以及轉移新的潛在靶點。隨后的實驗證明FMNL2在結直腸癌中與淋巴結的轉移相關，但與癌組織的浸潤深度、分化、腫瘤的位置無關，可能是通過影響細胞運動促進結直腸癌侵襲和轉移。朱曦齡博士沉默F(xiàn)MNL2基因后，發(fā)現(xiàn)結直腸癌細胞的體外生長、運動、侵襲及體內(nèi)肝轉移能力都受到抑制，同時與細胞運動相關的Rh

3、oA/ROCK信號通路蛋白的表達均降低，認為FMNL2參與Rho信號轉導通路;隨后Kitzing等應用siRNA技術屏蔽15種人Formin因子，發(fā)現(xiàn)FMNL2是選擇性的與有活性的RhoC反應，則認為FMNL2是RhoC的下游靶效應子。
　　 肝再生磷酸酶3(PRL3)是新近發(fā)現(xiàn)的一種具有促進細胞生長、浸潤和遷移的蛋白酪氨酸磷酸酶，屬于蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶家族成員。近年來研究發(fā)現(xiàn)，它與多種腫瘤的侵襲轉移密切相關，但其引發(fā)腫瘤轉移和

4、增強浸潤能力的作用機制尚不明確。Fiordalisi等研究體外結直腸癌細胞系SW480，發(fā)現(xiàn)PRL3高表達能夠引起結腸癌SW480細胞株小GTP酶活性改變，其中RhoA和RhoC表達增加4至5倍，Rac活性降低70％左右，對Cdc42沒有影響，表明Rho家族蛋白是PRL3相關信號通路的下游元件。
　　 綜上所述，F(xiàn)MNL2、RhoC以及PRL3在腫瘤組織高表達，與腫瘤轉移密切相關，涉及腫瘤轉移過程多個方面。綜合文獻FMNL2和R

5、ho蛋白之間存在怎樣的調(diào)控關系？FMNL2參與Rho細胞運動信號通路的哪個作用環(huán)節(jié)？FMNL2和PRL3蛋白之間是否存在調(diào)控關系？FMNL2與哪些靶蛋白發(fā)生相互作用？以上問題尚不清楚。
　　 二、研究目的
　　 本研究在此基礎上以RhoC-FMNL2路徑為主線，驗證FMNL2參與結直腸癌Rho細胞運動信號通路，確定FMNL2在通路中的作用環(huán)節(jié)和關鍵作用蛋白，同時我們認為FMNL2也參與PRL3調(diào)控信號傳導，通過探討PRL

6、3、RhoC、FMNL2三者關系可能涉及的相關信號通路，揭示FMNL2參與結直腸癌轉移的新機制，為結直腸癌轉移預測和靶向治療提供理論基礎。
　　 三、實驗方法
　　 1.FMNL2、RhoC和PRL3在結直腸癌組織中的表達及相互作用關系
　　 1.1結直腸癌石蠟標本及組織芯片制作
　　 標本收集:70例結直腸癌標本選自南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院病理科檔案石蠟組織塊，具有完整的臨床資料，本研究結直腸癌組織70例（

7、包括發(fā)生淋巴結轉移的31例，無淋巴結轉移39例;高中分化的62例，低分化的8例），淋巴結轉移癌31例（取自手術切除標本所附的淋巴結），其中男41例，女29例，年齡在23-83歲之間，中位年齡53歲。組織芯片制作:取樣前對蠟塊的切片作鏡下形態(tài)學觀察選取有典型組織形態(tài)學特點的區(qū)域，并在蠟塊確定取樣部位，使用組織微陣列儀在每個蠟塊穿取組織芯，每個組織蠟塊取3個孔，點樣直徑約1mm，制成的組織芯片備用。實驗分為轉移組31例和非轉移組39例，轉移

8、組取原發(fā)灶及轉移性淋巴結癌組織;非轉移組僅取原發(fā)灶癌組織。
　　 1.2免疫組織化學檢測
　　 組織芯片切片厚度5um，常規(guī)脫蠟脫水、抗原經(jīng)高壓鍋熱修復、封閉，常規(guī)HE染色，免疫組織（細胞）化學染色應用SP法，PRL3抗體、RhoC抗體(1∶100)、FMNL2抗體(1∶75)，操作步驟按試劑說明書進行，以PBS代替一抗作為陰性對照。
　　 2 FMNL2沉默后結直腸癌細胞系中RhoC、PRL3表達變化
　

9、　 2.1細胞培養(yǎng)
　　 結直腸癌細胞株SW620/FMNL2↓和SW620均為本實驗室自存，SW620屬于FMNL2高表達細胞株，來自結直腸癌的淋巴結轉移病灶;SW620/FMNL2↓為前期實驗基因沉默F(xiàn)MNL2表達的SW620細胞株。在37℃5％CO2條件下，培養(yǎng)于含5％胎牛牛血清的DMEM中，每周傳代2～3次，取生長狀態(tài)良好的細胞用于實驗。
　　 2.2免疫組化檢測不同結直腸癌細胞中RhoC、PRL3表達變化

10、r>　　 按照免疫組化試劑盒操作，首先制作細胞爬片，4％多聚甲醛固定20min，PRL3抗體、RhoC抗體（1∶100稀釋）作為一抗，4°過夜孵育，蘇木素復染，PBS液取代一抗作陰性對照。
　　 2.3應用Westblot檢測FMNL2沉默后結直腸癌細胞系中RhoC、PRL3蛋白表達變化。
　　 收集結直腸癌細胞后提取蛋白，用12％SDS-PAGE電泳分離，轉至PVDF膜，PVDF膜用5％脫脂奶粉進行封閉，加入兔抗人R

11、hoC、PRL3（1∶150稀釋）4℃孵育過夜，TBST洗膜5min×3次，加入二抗(1∶5000稀釋)的HRP標記室溫孵育1h，洗膜后經(jīng)化學發(fā)光自顯影成像，以β-actin為內(nèi)參對照。
　　 2.4 Real-time RT-PCR檢測結直腸癌細胞中表達變化
　　 提取總RNA1μg為模版，以oligo dT為引物，37℃反應15min，85℃5s，逆轉錄合成cDNA，以此cDNA鏈2μg為模板進行PCR擴增，通過相對

12、定量熒光定量 PCR檢測， RhoC引物序列上游5'-ATGCGTGCAATCCGAAAGAAG-3';下游5'-TCAGAGAATGGGACAGCCCCT-3'，PRL3上游引物為5'-AGGACGCCATCCAGTTCATC-3'，下游引物為5'-AGGTGAGCTGCTTGCTGTTA-3';以GAPDH為內(nèi)參，PCR反應條件為:95℃30s;95℃，5s;60℃34s;40個循環(huán)后，應用ABI PRISM7500 Fast Re

13、al-TimePCR擴增儀檢測各模板的Ct值，熒光信號檢測。定量方法:以Folds=2-△△Ct表示實驗組與對照組目的基因表達的倍比關系，實驗組為SW620/FMNL2↓細胞株，對照組為SW620細胞株;公式如下:△△Ct=(Ct(targetgene)-Ct(GAPDH))實驗組-(Ct(target gene)-Ct(GAPDH))對照組，實驗重復3次。
　　 3、統(tǒng)計學分析
　　 應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學

14、分析，免疫組化結果在OLYMPUS雙目顯微鏡高倍鏡(×400)下觀察，每例隨機觀察5個高倍鏡視野，計算著色細胞比，判斷結果:無著色細胞或陽性細胞≤5％為陰性（-/+），陽性細胞6％-30％為中度陽性(++)，陽性細胞31％-100％為強陽性(+++);結直腸癌細胞株使用Image-Pro Plus6.0病理圖像分析軟件計算出陽性細胞平均光密度（AOD值），實驗結果用中位數(shù)(Median，M)表示;所有結果均以mean±SD表示，臨床病理

15、特征分組統(tǒng)計采用Mann-whitney U檢驗，數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析和非參數(shù)秩和檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 四、結果
　　 1、FMNL2、RhoC及PRL3在結直腸癌組織及淋巴結轉移癌組織中的表達情況。
　　 免疫組化結果顯示，陽性表達均位于細胞質(zhì)或細胞膜，呈棕黃色或棕褐色顆粒，在正常結直腸粘膜中呈陰性或弱陽性，在結直腸癌及淋巴結轉移組織

16、中出現(xiàn)中強陽性表達。PRL3、RhoC及FMNL2淋巴結轉移灶中陽性表達率均明顯高于結直腸癌組織（P＜0.01）。在不同類型結直腸癌組織中可見，三者在有淋巴結轉移組中表達明顯比未伴有淋巴結轉移組增強，差異有具有顯著性（P＜0.01)，但陽性表達與病人的年齡、性別、腫瘤細胞分化程度無相關性（P＞0.05）。通過比較三種蛋白在同一病例原發(fā)癌的表達，兩兩比較發(fā)現(xiàn)，RhoC與PRL3表達有相關性(r=0.355)，RhoC與FMNL2表達也存在

17、有相關性(r=0.414)，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　 2、細胞免疫組化結果
　　 PRL3、RhoC陽性表達呈棕黃色顆粒，均定位于細胞質(zhì)。測量陽性細胞強弱用平均光密度(AOD)表示，RhoC蛋白在SW620細胞、SW620/FMNL2↓細胞中AOD值分別為0.2411±0.0157、0.1245±0.0128，差異有統(tǒng)計學意義(F=50.487，P＜0.05);而PRL-3蛋白的AOD值分別為0.224

18、9±0.02543，0.1773±0.05608(P＞0.05)差異無統(tǒng)計學意義。
　　 3、Westblot檢測結果
　　 以β-actin為內(nèi)參對照，結果顯示SW620/FMNL2↓細胞與β-actin灰度值比值為0.820±0.033，明顯低于SW620細胞組1.214±0.060(P＜0.05)，F(xiàn)MNL-2表達沉默后，RhoC蛋白表達明顯下降;PRL3蛋白表達在SW620細胞以及SW620/FMNL2↓細胞中與

19、β-actin灰度值比值分別為0.835±0.061;0.686±0.018組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.082＞0.05)。
　　 4、RT-PCR檢測結果
　　 Real-time PCR結果顯示均有擴增，擴增曲線均進入平臺期，溶解曲線未見雜峰，顯示擴增為非特異性序列。通過公式計算發(fā)現(xiàn)，SW620細胞株為對照組，SW620/FMNL2↓細胞中RhoC mRNA的表達水平是SW620的0.618倍，差異有統(tǒng)計學意義