基于實(shí)時PCR的結(jié)核分枝桿菌分子診斷的研究.pdf

1、本論文包含三部分內(nèi)容，第一部分采用實(shí)時PCR技術(shù)建立了結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC）的檢測體系。第二部分采用磁珠法建立痰液中結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)基因組的提取方法，并通過第一部分建立的檢測體系評價提取效果，最終利用實(shí)時PCR技術(shù)和磁珠法提取方案，實(shí)現(xiàn)了痰液標(biāo)本中MTB的高靈敏度的檢測。第三部分利用實(shí)時PCR技術(shù)建立

2、了一種可以同時檢測MTBC以及臨床和環(huán)境中常見非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)的方法。
　　 第一部分，建立了MTBC的實(shí)時PCR檢測體系。培養(yǎng)法是檢測MTB的金標(biāo)準(zhǔn)。但是，由于MTB生長緩慢，一般培養(yǎng)大約需要3～4周，如果是陰性結(jié)果則需要時間更長才能報告檢測結(jié)果，加之培養(yǎng)環(huán)境的特殊性，使其不利于應(yīng)用到臨床和基層的MTB檢測的工作中。痰液涂片鏡檢的速度雖快，但是靈敏度低，易出現(xiàn)漏

3、檢，且不能區(qū)分MTB和NTM，從而導(dǎo)致假陽性結(jié)果出現(xiàn)。因此需要一種簡單快速、靈敏度高、特異性好的方法應(yīng)用于臨床MTB檢測。本實(shí)驗(yàn)針對MTBC基因組中特有的IS6110插入序列設(shè)計引物和探針，以實(shí)時PCR技術(shù)為檢測平臺，實(shí)現(xiàn)了對MTB的快速檢測。共檢測了100份培養(yǎng)陽性的菌株，本方法檢測結(jié)果與培養(yǎng)標(biāo)本檢測結(jié)果一致率達(dá)到100％(100/100)。對105份臨床痰液標(biāo)本的檢測結(jié)果與痰涂片鏡檢結(jié)果相比，靈敏度為98.3％(59/60)，特異性

4、為88.8％(40/45)。
　　 第二部分:實(shí)現(xiàn)了痰液中MTB基因組DNA的磁珠法提取。結(jié)核病人的痰液樣本中含有大量的粘蛋白、細(xì)菌、人體細(xì)胞和呼吸道分泌物等，若用核酸擴(kuò)增方法對痰液中MTB進(jìn)行檢測，則需要克服痰液中的雜質(zhì)對PCR反應(yīng)體系的抑制作用。使用磁珠法可以有效提高提取模板的純度，于是我們利用磁珠法對痰液中的MTB基因組DNA進(jìn)行提取，建立了磁珠法提取痰液中MTB基因組DNA的方法，并通過第一部分建立的體系評價了提取效果。

5、最后通過檢測臨床標(biāo)本進(jìn)一步驗(yàn)證。一共檢測了有痰涂片結(jié)果的痰液標(biāo)本140份，與痰涂片結(jié)果相比靈敏度為100％(85/85)，特異性為69.1％(38/55)。同時檢測了痰涂片陽性標(biāo)本144份，這些標(biāo)本有培養(yǎng)結(jié)果對照，實(shí)時PCR檢測結(jié)果與培養(yǎng)結(jié)果相比靈敏度為100％(112/112)，特異性為37.5％(12/32)。
　　 第三部分，建立了一種可以同時檢測MTBC以及常見NTM的實(shí)時PCR檢測體系。近年來，艾滋病的流行、人口的老齡

6、化、服用免疫抑制劑等因素導(dǎo)致人們免疫力低下，使得分枝桿菌病的感染率和發(fā)病率呈逐漸上升趨勢。因此找到一種能快速檢測出分枝桿菌的方法，這對于有效地防治該病有非常重要的意義。本論文建立了一種可以同時檢測MTBC及臨床和環(huán)境中常見的23種NTM的檢測體系。檢測體系通過了國家參考品盤和臨床標(biāo)本的驗(yàn)證，結(jié)果證明此體系可用于分枝桿菌感染的快速篩查。共檢測了90份痰液標(biāo)本，其中45份涂片陽性標(biāo)本中，39份檢測出含有MTB，6份標(biāo)本同時含有MTB和NTM