淇河鯽TLR5-TLR22及信號通路關(guān)鍵基因克隆、表達分析及功能研究.pdf

1、魚類作為低等脊椎動物，其特異性免疫尚不完善，非特異性免疫在魚類對外界刺激及病原微生物侵襲的防御反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。Toll樣受體是非特異性免疫中一類重要的模式識別受體，能特異性地識別病原相關(guān)分子模式，通過細(xì)胞內(nèi)信號通路的傳遞，進一步引發(fā)細(xì)胞的免疫應(yīng)答，在魚類免疫中發(fā)揮重要作用。淇河鯽（Qihe crucian carp，Carassius auratus）是河南特有的天然三倍體魚類。近年來，隨著淇河鯽養(yǎng)殖范圍擴大，養(yǎng)殖密度增加，魚

2、類免疫力下降，疾病逐漸增多，從而給漁業(yè)生產(chǎn)帶來重大損失。因此，弄清病原菌感染后淇河鯽模式識別受體免疫應(yīng)答機制，對于理解淇河鯽免疫應(yīng)答和疾病防控具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是淡水養(yǎng)殖魚類暴發(fā)性傳染病最主要的病原菌之一，常引起淇河鯽細(xì)菌性出血病，嚴(yán)重制約著淇河鯽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。目前，淇河鯽感染嗜水氣單胞菌后免疫反應(yīng)的研究主要集中于生化指標(biāo)測定和免疫基因表達變化，對淇河鯽模式識別受體免

3、疫應(yīng)答機制缺少系統(tǒng)研究。
　　本論文以淇河鯽為研究對象，首先克隆其13種TLRs的部分片段，實時熒光定量PCR檢測嗜水氣單胞菌攻毒后TLRs在脾臟和頭腎中的表達變化，篩選出上調(diào)表達最為明顯的TLR5和TLR22;然后對TLR5和TLR22及信號通路下游關(guān)鍵元件MyD88和TRAF6進行克隆，從而獲得cDNA及基因組DNA全長序列，運用生物信息學(xué)方法進行結(jié)構(gòu)預(yù)測及同源性分析;實時熒光定量PCR檢測胚胎發(fā)育不同時期基因的表達變化、淇河

4、鯽不同組織器官中的基因表達以及攻毒后各基因的表達響應(yīng)。通過對基因進行原核表達，制備多克隆抗體，以研究蛋白表達;通過構(gòu)建真核表達載體，轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系，檢測相應(yīng)分子的亞細(xì)胞定位及基因過表達后對下游NF-κB活性的調(diào)控作用。取得主要結(jié)果如下:
　　(1)以淇河鯽脾臟cDNA為模板，利用簡并引物進行PCR擴增，得到13種TLRs(分別為TLR1、2、3、4、5、7、8、9、18、19、20、21和22)的部分片段。實時熒光定量P

5、CR檢測嗜水氣單胞菌攻毒后不同時間(3、6、12、24和48 h)脾臟和頭腎中13種TLRs的表達變化，結(jié)果顯示TLR5和TLR22的表達上調(diào)最為明顯，最高值分別達到了對照組的52.56倍和28.14倍，表明二者在淇河鯽防御嗜水氣單胞菌感染的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，可能是淇河鯽識別嗜水氣單胞菌的主要受體。同時，這也是對淡水魚感染革蘭氏陰性細(xì)菌后所有已知Toll樣受體表達模式的首次研究。
　　(2)克隆得到淇河鯽TLR5、TLR2、

6、MyD88和TRAF6 cDNA及基因組DNA全長序列。①TLR5 cDNA序列全長2972 bp，包含5'-UTR140 bp、開放閱讀框2649 bp和3'-UTR183 bp，編碼882個氨基酸;預(yù)測蛋白相對分子量為101.5 kD，理論等電點為5.33;含有1個信號肽、13個LRR基序、1個LRR-CT基序、1個跨膜區(qū)和1個TIR結(jié)構(gòu)域;DNA序列含有一個長度為223 bp的內(nèi)含子，位于5'-UTR。②TLR22 cDNA序列全

7、長3613 bp，包含5'-UTR228 bp、開放閱讀框2838 bp和3'-UTR547 bp，編碼945個氨基酸;預(yù)測蛋白相對分子量為108.4kD，理論等電點為8.65;含有1個信號肽、15個LRR基序、1個LRR-CT基序、1個跨膜區(qū)和1個TIR結(jié)構(gòu)域;DNA序列中沒有內(nèi)含子。③yD88 cDNA序列全長2463bp，包含5'-UTR191 bp、開放閱讀框855bp和3'-UTR1417bp，編碼284個氨基酸;預(yù)測蛋白相對

8、分子量為33.1 kD，理論等電點為5.53;含有1個DEATH結(jié)構(gòu)域和1個TIR結(jié)構(gòu)域;DNA序列由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成。④TRAF6 cDNA序列全長2555 bp，包含5'-UTR52bp、開放閱讀框1632 bp和3'-UTR871 bp，編碼543個氨基酸;預(yù)測蛋白相對分子量為61.7 kD，理論等電點為5.81;其蛋白質(zhì)由5個結(jié)構(gòu)域組成，分別是1個RING結(jié)構(gòu)域、2個Zf-TRAF結(jié)構(gòu)域、1個CCR結(jié)構(gòu)域和1個MATH

9、結(jié)構(gòu)域;DNA序列由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成。⑤對不同魚類中氨基酸全長序列進行同源性分析，結(jié)果表明TLR5、TLR22、MyD88和TRAF6在魚類中高度保守，推測其在魚類中扮演重要的生物學(xué)功能。
　　(3)淇河鯽TLR5、TLR2、MyD88和TRAF6在個體發(fā)育早期階段廣泛表達，說明在淇河鯽胚胎及仔魚發(fā)育的整個過程中起著重要的免疫保護作用。受精卵中表達量較高，均屬于母源性基因，隨著受精卵的發(fā)育，對母源性基因mRNA的消耗，胚

10、胎中基因表達量逐漸降低，分別在原腸胚期（TLR5）、尾芽期（TLR22）、出膜期（MyD88和TRAF6）達到最低值，胚胎出膜后基因表達量明顯增加。這一研究結(jié)果提示:在魚類受精卵發(fā)育過程中，出膜前是免疫水平和抗病能力最薄弱階段，需加強照管，防止病原菌侵染魚類胚胎。
　　(4)淇河鯽TLR5、TLR2、MyD88和TRAF6在不同組織器官中呈組成型表達，但其mRNA表達水平具有明顯的組織特異性。①TLR5在腎臟中表達量最高，其次是肝

11、臟、頭腎、心臟和肌肉，鰓中表達量最低。②TLR22在頭腎中表達量最高，其次是腎臟、肌肉、肝臟和腸道;心臟和腦中表達量偏低。③MyD88在脾臟中表達量最高，肝臟、血液、肌肉、頭腎、腎臟和鰓次之，皮膚中表達量最低。④TRAF6在肌肉中表達量最高，血液次之，脾臟、腎臟、頭腎、皮膚和腸道中表達水平差異不顯著，鰓中表達量偏低。
　　(5) PolyI:C、鞭毛蛋白和嗜水氣單胞菌攻毒后淇河鯽TLR5和TLR22及其信號通路關(guān)鍵分子均表現(xiàn)出明顯

12、的表達響應(yīng)，充分顯示了細(xì)菌感染后TLRs及信號通路關(guān)鍵元件在淇河鯽免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。攻毒后淇河鯽TLR5和TLR22的表達峰值多出現(xiàn)在早期(3-12 h)，MyD88表達峰值多出現(xiàn)在處理后24 h，說明信號通路上不同元件的表達響應(yīng)存在時間差異。攻毒后淇河鯽促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-8和TNFα的表達普遍上調(diào)，其中IL-1β的表達量特別高，說明其在魚類免疫中發(fā)揮重要作用。
　　(6)利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達并純化了淇河

13、鯽TLR5、TLR22和TRAF6部分片段以及MyD88全長的融合蛋白，分別用純化蛋白免疫小鼠，成功制備相應(yīng)多克隆抗體，為進一步通過標(biāo)記蛋白質(zhì)進行相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。
　　(7)構(gòu)建GFP標(biāo)記的真核表達重組載體，然后轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系，激光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示TLR5/22-TIR結(jié)構(gòu)域融合蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中靠近細(xì)胞膜的位置，這預(yù)示著淇河鯽TLR5/22全長分子可能位于細(xì)胞膜上;MyD88和TRA

14、F6則位于細(xì)胞質(zhì)中。
　　(8)目的片段與pcDNA3.1連接構(gòu)建真核表達重組載體，分別與NF-κB熒光素酶報告基因載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系，利用雙熒光素酶報告基因檢測法測定目的基因過表達對NF-κB活性的影響，結(jié)果顯示過表達TLR5-TIR結(jié)構(gòu)域、TLR22-TIR結(jié)構(gòu)域和MyD88均能顯著增加NF-κB的活性，表明三者在哺乳動物細(xì)胞中能正常行使其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，激活下游信號通路;但過表達TRAF6對NF-κB的活性沒有明顯