伽瑪?shù)墩丈鋵?duì)大鼠皮層神經(jīng)元NMDA受體和電壓依賴(lài)性鈉電流的影響.pdf

1、癲癇是由各種原因引起的腦功能障礙綜合征，即腦細(xì)胞群異常放電所致的發(fā)作性、暫時(shí)性的腦功能紊亂，具有反復(fù)性、陣發(fā)性、發(fā)作性等特點(diǎn)。我國(guó)每年新增癲癇病人30余萬(wàn)，估計(jì)已有癲癇病人455萬(wàn)～630萬(wàn)人，至少有約80萬(wàn)～100萬(wàn)癲癇病人癲癇發(fā)作藥物難以控制，長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作成為藥物難治性癲癇，成為臨床治療中的難題。 隨著立體定向放射神經(jīng)外科的興起，伽瑪?shù)冻蔀椴婚_(kāi)顱治療顱內(nèi)病變的重要手段。尤其是可進(jìn)行術(shù)前無(wú)創(chuàng)性致癇灶定位的腦磁圖(magneto

2、encephalogram，MEG)的出現(xiàn)，更推動(dòng)了伽瑪?shù)对谒幬镫y治性癲癇治療中的應(yīng)用。立體定向放射外科的臨床資料提示，伽瑪?shù)犊梢栽诓粨p傷靶區(qū)組織正常功能的情況下減少或治愈癲癇發(fā)作。 N-甲基-D-天氡氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體是離子型谷氨酸受體的一種亞型，與特性性配體結(jié)合后離子通道開(kāi)放，具有高的Ca2+滲透性，Ca2+的內(nèi)流可觸發(fā)不同形式的突觸可塑性(突觸可塑性指的是突觸的形態(tài)、大小、數(shù)目及

3、遞質(zhì)受體等改變引起突觸傳遞功效改變)分子過(guò)程，因而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸傳遞和突觸可塑性調(diào)節(jié)中起著重要的作用。癲癇的病因和病理機(jī)制非常復(fù)雜，但NMDA受體與癲癇的關(guān)系已經(jīng)較為肯定。有研究表明，NMDA受體在癲癇的發(fā)生發(fā)展及持續(xù)過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。 在癲癇的病因?qū)W研究中，目前發(fā)現(xiàn)少數(shù)幾種原發(fā)性癲癇是由離子通道的基因突變所致，提示離子通道本身結(jié)構(gòu)和功能的變化與癲癇發(fā)病密切相關(guān)。其中，電壓門(mén)控鈉離子通道結(jié)構(gòu)和功能異常在癲癇的發(fā)生發(fā)展中

4、占有重要地位。 第一部分伽瑪?shù)秾?duì)大鼠皮層神經(jīng)元NMDA受體表達(dá)的影響 目的：觀察伽瑪?shù)墩丈鋵?duì)大鼠額葉NMDAR亞基蛋白、mRNA表達(dá)的影響。 方法：通過(guò)立體定向技術(shù)，對(duì)18只雄性健康Wistar大鼠(隨機(jī)分為2個(gè)劑量組)進(jìn)行伽瑪?shù)墩丈洌行膭┝糠謩e為30 Gy和60 Gy。于照射后24 h、30 d、60 d取材，通過(guò)免疫組織化學(xué)、原位雜交等方法檢測(cè)靶區(qū)腦組織NR1、NR2A、NR2B蛋白和mRNA的表達(dá)。

5、 結(jié)果：中心劑量30 Gy伽瑪射線照射后1d和30d，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比，靶區(qū)皮層神經(jīng)元NR1、NR2A和NR2B蛋白和mRNA表達(dá)均未發(fā)生顯著性改變，照射后60 d，靶區(qū)皮層神經(jīng)元NR1和NR2A蛋白和mRNA表達(dá)均顯著增強(qiáng)，但未檢測(cè)到NR2B蛋白和mRNA表達(dá)變化。與對(duì)照組相比，60 Gy組大鼠靶區(qū)皮層神經(jīng)元NR1、NR2A和NR2B蛋白和mRNA在照射后30 d開(kāi)始表達(dá)增強(qiáng)，一直持續(xù)到照射后60 d。但皮層神經(jīng)元NR2B蛋白和m

6、RNA表達(dá)在觀察期內(nèi)未發(fā)生顯著變化。在觀察期內(nèi)，靶區(qū)尾狀核區(qū)域神經(jīng)元NR1、NR2A和NR2B蛋白和mRNA表達(dá)均未發(fā)生顯著性改變。 結(jié)論：伽瑪?shù)兑鸢袇^(qū)皮層神經(jīng)元內(nèi)NMDA受體亞基蛋白和mRNA表達(dá)升高，可能是伽瑪?shù)吨委熾y治性癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的機(jī)制之一。 第二部分伽瑪?shù)秾?duì)大鼠皮層神經(jīng)元胞漿內(nèi)游離鈣離子水平的影響 目的：觀察伽瑪?shù)秾?duì)正常大鼠皮層神經(jīng)元胞漿內(nèi)游離鈣離子水平的影響。 方法：24只雄性Wist

7、ar大鼠隨機(jī)分為假照射組和兩個(gè)照射組，兩個(gè)照射組以大鼠左側(cè)額葉為靶區(qū)進(jìn)行伽瑪?shù)墩丈?，中心劑量分別為30 Gy(9只動(dòng)物)和60 Gy(9只動(dòng)物)，于照射后24 h、30 d、60 d處死動(dòng)物，急性分離皮層神經(jīng)元并負(fù)載游離鈣離子熒光染料fluo-3，激光共聚焦顯微鏡觀察皮層神經(jīng)元胞漿內(nèi)游離鈣離子濃度。 結(jié)果：伽瑪?shù)墩丈浜?4 h，兩照射組大鼠靶區(qū)皮層神經(jīng)元胞漿內(nèi)游離鈣離子熒光強(qiáng)度與假照射組相比無(wú)顯著性差異。伽瑪?shù)墩丈浜?0 d，3

8、0 Gy組大鼠靶區(qū)皮層神經(jīng)元胞漿內(nèi)游離鈣離子熒光強(qiáng)度與對(duì)照組相比無(wú)顯著變化，60 Gy組靶區(qū)皮層神經(jīng)元胞漿內(nèi)游離鈣離子熒光強(qiáng)度顯著高于假照射組，P<0.05。伽瑪?shù)墩丈浜?0 d，兩照射組大鼠靶區(qū)皮層神經(jīng)元胞漿內(nèi)游離鈣離子熒光強(qiáng)度均顯著高于假照射組，P<0.05。 結(jié)論：伽瑪?shù)犊赡芡ㄟ^(guò)上調(diào)NMDA受體亞基表達(dá)水平引起靶區(qū)神經(jīng)元胞漿內(nèi)游離鈣離子水平在較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)保持相對(duì)超載狀態(tài)。 第三部分伽瑪?shù)墩丈鋵?duì)體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元N

9、MDA誘導(dǎo)電流的影響 目的：觀察伽瑪?shù)秾?duì)體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元NMDA誘導(dǎo)電流的影響。 方法：將原代培養(yǎng)的新生大鼠皮層神經(jīng)元隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和4個(gè)相應(yīng)的對(duì)照組，通過(guò)立體定向技術(shù)和18 mm準(zhǔn)直器對(duì)實(shí)驗(yàn)組原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元實(shí)施伽瑪?shù)墩丈洌行膭┝?0Gy。4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和相應(yīng)對(duì)照組神經(jīng)元分別于照射后1、3、7、10 d分別通過(guò)免疫蛋白印跡和膜片鉗技術(shù)檢測(cè)NMDA受體亞基蛋白表達(dá)情況和在全細(xì)胞模式下記錄神經(jīng)元靜息電位和NM

10、DA誘導(dǎo)電流，每組記錄神經(jīng)元6-8個(gè)。 結(jié)果：免疫蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果提示，伽瑪?shù)墩丈浜?、7、10 d，原代培養(yǎng)神經(jīng)元NMDA受體亞基NR1和NR2A表達(dá)顯著增強(qiáng)，與對(duì)照組相比，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。伽瑪?shù)墩丈浜?、3、7、10 d，NMDA受體亞基NR2B表達(dá)與對(duì)照組相比無(wú)顯著性變化。電生理學(xué)結(jié)果顯示，伽瑪?shù)墩丈浜?、7、10 d，通過(guò)膜片鉗記錄神經(jīng)元NMDA誘導(dǎo)電流，照射組皮層神經(jīng)元的INMDA峰值密度(pA/pf)

11、均顯著高于對(duì)照組皮層神經(jīng)元的INMDA峰值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。 結(jié)論：伽瑪?shù)墩丈淇梢栽鰪?qiáng)NMDA誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元內(nèi)向電流。 第四部分伽瑪?shù)墩丈鋵?duì)體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)電壓依賴(lài)性鈉電流的影響 目的：觀察伽瑪?shù)秾?duì)體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元電壓依賴(lài)性鈉電流的影響。 方法：將原代培養(yǎng)的神經(jīng)元隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和4個(gè)相應(yīng)的對(duì)照組，通過(guò)立體定向技術(shù)和18 mm準(zhǔn)直器對(duì)實(shí)驗(yàn)組原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元實(shí)施伽瑪?shù)墩丈?/p>

12、，中心劑量30 Gy。4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和相應(yīng)對(duì)照組神經(jīng)元分別于照射后1、3、7、10 d通過(guò)膜片鉗技術(shù)在全細(xì)胞模式下記錄電壓依賴(lài)性鈉電流，每組記錄神經(jīng)元6-8個(gè)。 結(jié)果：伽瑪?shù)墩丈浜?、3、7、10 d通過(guò)膜片鉗記錄神經(jīng)元電壓依賴(lài)性鈉電流，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組皮層神經(jīng)元電壓依賴(lài)性鈉電流峰值密度(pA/pF)分別為89.94±4.65、84.13±4.56、80.27±5.18和80.80±5.41，與對(duì)照組(照射后1、3、7、10 d分別