蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制成脂并介導(dǎo)TNFα在肥胖中的作用.pdf

1、蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)是機體廣泛表達的非受體型酪氨酸磷酸酶，與腫瘤、代謝、心血管、自身免疫及神經(jīng)功能紊亂等許多疾病相關(guān)，尤以其對葡萄糖及胰島素穩(wěn)態(tài)的負性調(diào)節(jié)而受到密切關(guān)注。PTP1B敲除小鼠呈現(xiàn)顯著的低體重、低體脂及對飲食誘導(dǎo)肥胖的抵抗，然而這種現(xiàn)象似乎存在一定的組織特異性:脂肪特異性PTP1B敲減小鼠并未出現(xiàn)良性體重調(diào)節(jié)，而PTP1B缺乏的離體脂肪組織中亦未見胰島素受體磷酸化水平及葡萄糖攝取功能的變化，提示PTP1B對脂肪

2、組織中的胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能無主導(dǎo)作用。與此同時，大量證據(jù)顯示肥胖脂肪組織中普遍存在PTP1B表達的上調(diào)，這讓我們不禁思考其在調(diào)節(jié)胰島素敏感性以外的重要意義。
　　 肥胖的實質(zhì)是能量攝入與消耗失衡所引起的病理性脂質(zhì)累積。脂肪細胞為儲存過剩的能量而肥大并繼發(fā)分化功能障礙，肥胖個體無法產(chǎn)生新的儲脂細胞，過載的脂質(zhì)流入循環(huán)、骨骼肌、肝臟甚至胰島β細胞，形成異位沉積。在這一過程中，促炎脂肪因子TNFα的活化發(fā)揮了重要作用。TNFα在各種肥

3、胖動物模型及人群的脂肪組織中亦存在顯著的過表達，并引發(fā)包括分化功能障礙在內(nèi)的脂肪微環(huán)境病理改變，然而其分子機制尚未闡明。另一方面，PTP1B似乎與部分成脂相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄相關(guān)，但現(xiàn)有研究結(jié)果因?qū)嶒灄l件和對象不同而模棱兩可。
　　 因此，本研究擬探討PTP1B對脂肪分化功能的影響及作用位點，并在此基礎(chǔ)上初步驗證其對肥胖時炎癥與脂肪功能障礙的貢獻，以期揭示PTP1B在肥胖發(fā)生發(fā)展中的意義，并為其臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。
　　

4、 一、PTP1B對成脂的負性調(diào)節(jié)作用
　　 我們分別構(gòu)建了攜帶PTP1B cDNA序列、RNA干擾寡核苷酸及活性位點突變DNA序列的慢病毒并轉(zhuǎn)染3T3-L1小鼠白色前脂肪細胞系。其中PTP1B雙突變體(PTP1B-D/A-Y/F)替換了其分子催化域中兩個關(guān)鍵氨基酸Tyr-46和Asp-181，使其保留與底物結(jié)合的能力而失去催化活性，在本研究中作為序列突變對照被引入。對病毒綠色熒光蛋白的檢測顯示整合基因不受細胞傳代、分化甚至凍存的

5、影響;過表達組細胞內(nèi)PTP1B蛋白水平升高1.71±0.02倍，而敲減組則減少至13.14±0.04％，突變組亦降低至58.83±0.27％，提示PTP1B穩(wěn)定過表達、敲減及突變脂肪細胞模型的建立。以經(jīng)典“雞尾酒”法誘導(dǎo)三組細胞分化，于誘導(dǎo)后第8天收集細胞并評估分化情況。結(jié)果顯示:過表達組細胞分化明顯延遲，成熟脂肪細胞比率不足60％，且形態(tài)不典型，油紅O染色吸光度僅為對照的67.15±0.62％;敲減組分化顯著增強，幾乎均呈成熟脂肪細胞

6、形態(tài)，細胞變圓變大，胞漿內(nèi)脂滴豐富，油紅O染色吸光度亦明顯高于對照;突變組呈現(xiàn)與敲減模型相同的成脂促進作用，其成熟脂肪細胞比率及油紅O染色吸光度亦顯著高于對照。對成脂重要標志物的檢測也得到相同結(jié)果:過表達組PPARγ2、SREBP-1c、FAS及LPL基因表達顯著下調(diào)，而敲減及突變組則均增強;其中PPARγ2變化最大，在過表達組抑制至11.05±1.43％，而在敲減組則升高8.14±0.46倍，SREBP-1c也在敲減組升高12.52±

7、1.41倍，C/EBPα的表達則在三組均無改變。
　　 在脂肪細胞的終末分化中，PPARγ2與C/EBPα同在早期活化，并在成熟脂肪細胞中維持高水平;SREBP-1c在分化前期被激活，并繼而活化包括FAS、LPL在內(nèi)的眾多脂肪酸合成基因。我們的數(shù)據(jù)顯示，PTP1B主要通過下調(diào)PPARγ2而非C/EBPα的轉(zhuǎn)錄水平抑制成脂，同時伴有脂質(zhì)合成基因SREBP-1c、FAS、LPL等的平行變化。PTP1B-D/A-Y/F突變體過表達對P

8、TP1B有顯著的負顯性抑制作用，這在以往應(yīng)用底物捕獲突變體的研究中從未報道。這種負顯性抑制作用主要源于突變體“捕獲”底物的高效性:強有力地與底物結(jié)合而不催化，從而競爭性抑制了內(nèi)源性PTP1B的功能;而PTP1B-D/A-Y/F慢病毒對宿主基因組的整合似乎也能下調(diào)內(nèi)源性PTP1B的表達。本部分通過特異性PTP1B過表達、敲減及負顯性突變?nèi)N細胞模型，一致證實了PTP1B對白色前脂肪細胞成脂的重要調(diào)節(jié)作用。
　　 二、PTP1B介導(dǎo)

9、肥胖時TNFα誘導(dǎo)的脂肪分化不良
　　 為進一步闡明PTP1B對脂肪分化調(diào)節(jié)作用在肥胖中的作用，我們對高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠的附睪脂肪組織進行檢測。PTP1B與促炎脂肪因子TNFα在肥胖脂肪組織中存在明顯重疊的過表達，同時伴有脂肪分化關(guān)鍵因子PPARγ2表達的下調(diào)。TNFα持續(xù)干預(yù)使3T3-L1前脂肪細胞分化能力明顯受損，誘導(dǎo)后第8天分化率僅50～60％;而PTP1B表達卻得到增強，尤其在第6-8天其蛋白水平為對照的2倍以上。然而

10、在PTP1B功能受到抑制的突變體過表達3T3-L1細胞上，TNFα對脂肪分化的干預(yù)也明顯減弱，提示PTP1B在TNFα的成脂抑制作用中扮演重要角色。最后，我們回到肥胖小鼠上探討PTP1B對成脂調(diào)節(jié)的體內(nèi)變化。以PTP1B經(jīng)典抑制劑釩酸鈉處理6周的肥胖(ob/ob)小鼠，其飲水量受影響，攝食、總體重與對照比較無差異，增重呈下降趨勢;葡萄糖耐量在60、120 min時明顯改善。附睪脂肪組織比率無改變，但脂肪組織局部SREBP-1c、FAS等

11、脂質(zhì)合成基因明顯上調(diào)，PPARγ2表達略上升但無統(tǒng)計學(xué)意義;TNFα基因表達及其下游重要靶點NFκB活性下調(diào)。
　　 脂肪細胞功能失調(diào)是肥胖等許多代謝疾病的中心病理環(huán)節(jié)。前脂肪細胞增殖及分化能力障礙是脂肪細胞參與胰島素抵抗、代謝綜合征和2型糖尿病發(fā)生的重要因素。我們的結(jié)果提示PTP1B可能是肥胖時連接炎癥浸潤與脂肪功能受損的重要橋梁，其在肥胖脂肪組織中被TNFα過度激活，并介導(dǎo)了成脂抑制作用;而PTP1B抑制劑治療可能通過改善肥

12、胖動物脂肪組織的成脂功能，減輕游離脂肪酸過載，而減輕局部炎癥反應(yīng)，最終為整體胰島素抵抗的改善做貢獻。NFκB可能是PTP1B與TNFα相互作用的中間環(huán)節(jié)。
　　 綜上所述，我們提出PTP1B參與肥胖脂肪組織病理變化的可能機制:隨著肥胖的進展，增大的脂肪細胞儲脂能力超負荷，脂肪組織內(nèi)分泌功能受損，大量分泌的TNFα通過激活PTP1B的表達抑制前脂肪細胞內(nèi)PPARγ2、SREBP-1c、FAS、LPL等重要成脂因子的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致脂