陸地棉農(nóng)桿菌介導(dǎo)法共轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)兔角蛋白和蠶絲心蛋白基因改良纖維品質(zhì)的研究.pdf

1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化效率高，且T-DNA插入相對(duì)穩(wěn)定，易獲得目的基因穩(wěn)定表達(dá)和表型正常的植株，一直是生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因棉花的主流技術(shù)。通過(guò)此方法獲得的抗蟲棉和抗除草劑棉花已在全球得到了廣泛應(yīng)用。抗蟲棉除了單價(jià)的Bt基因之外，雙價(jià)(Bt+CpT1，Bt+GNA，Bt+sck)或三價(jià)(Bt+CpT1+GNA)抗蟲棉都成功地應(yīng)用于改善棉花的抗蟲性，拓寬了抗蟲譜?？钩輨┟藁ū怀晒ν茝V的有抗草甘膦棉花，抗草丁膦棉花，抗2. 4-D棉花等。近年來(lái)，研究者

2、開始將外源基因?qū)朊藁▉?lái)提高棉花的纖維品質(zhì)，包括纖維強(qiáng)度、長(zhǎng)度、保暖性能和纖維顏色等。 本研究將分別包含Bt+ sck雙價(jià)基因、bar基因、兔角蛋白基因(keratin)和蠶絲心蛋白基因(fibroin)4個(gè)表達(dá)載體的LBA4404農(nóng)桿菌工程菌株于25℃過(guò)夜懸浮培養(yǎng)后，菌液等摩爾混合侵染中國(guó)長(zhǎng)江流域棉花主栽品種泗棉3號(hào)和品系WC，進(jìn)行共轉(zhuǎn)化的研究。得到113塊胚性愈傷系，其中有82個(gè)胚性愈傷組織系形成胚狀體，最終獲得820株再生

3、植株(每個(gè)胚性愈傷組織系取10株)。提取再生植株葉片的DNA，對(duì)標(biāo)記基因(nptII)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，710株陽(yáng)性植株在溫室嫁接，成活了566株，成活率約為80％。PCR檢測(cè)和Southern雜交表明獲得了不同基因組合的再生植株；以PCR結(jié)果分析了共轉(zhuǎn)化的效率，結(jié)果顯示，導(dǎo)入單個(gè)基因、兩個(gè)基因、三個(gè)基因和同時(shí)導(dǎo)入4個(gè)基因的再生植株比例分別為48.17％、20.61％、8.29％和6.46％。同時(shí)導(dǎo)入兩個(gè)以上載體的目的片段的共轉(zhuǎn)化植株

4、占總轉(zhuǎn)化植株的35％。RT-PCR檢測(cè)、卡那抗性檢測(cè)、GUS組織化學(xué)檢測(cè)和PPT抗性檢測(cè)等表明共轉(zhuǎn)化的基因在T0代得到了表達(dá)。通過(guò)共轉(zhuǎn)化途徑獲得各種基因組合的棉花，可為不同的育種需求提供材料和技術(shù)支持。 在獲得多種基因組合的共轉(zhuǎn)化棉花的基礎(chǔ)上，通過(guò)田間和室內(nèi)卡那霉素抗性鑒定、田間和室內(nèi)PPT抗性篩選以及對(duì)目的基因進(jìn)行PCR檢測(cè)，研究了不同轉(zhuǎn)化事件中的各個(gè)目的基因在后代(T1和T2)的遺傳和表達(dá)特點(diǎn)，同時(shí)對(duì)各種基因組合的株系進(jìn)行了

5、純合選育，對(duì)于共轉(zhuǎn)化材料進(jìn)一步應(yīng)用于育種實(shí)踐具有重要的指導(dǎo)意義。結(jié)果證明，在獲得足夠種子的不同的株系中，T1植株中單個(gè)目的基因分離大都符合一對(duì)基因所表現(xiàn)的3：1比例(卡方值都小于X20.05，1=3.84)；在淘汰了T1陰性植株后，T2代株系的單個(gè)目的基因表現(xiàn)為純合或3：1的分離，說(shuō)明對(duì)于單一基因來(lái)說(shuō)一般以單拷貝或低拷貝插入。分別獲得了單轉(zhuǎn)bar基因、Bt+ sck雙價(jià)基因、ker或fib基因的純系若干，以及部分兩個(gè)基因組合的純系。對(duì)含

6、有Bt+sck的基因進(jìn)行室內(nèi)接蟲檢測(cè)；含有bar基因抗PPT篩選；含有ker和fib基因的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行報(bào)告基因gus表達(dá)分析，證明目的基因在后代能夠遺傳和表達(dá)，有望在育種實(shí)踐中得到應(yīng)用。 將纖維特異啟動(dòng)子GAE6-3A驅(qū)動(dòng)兔角蛋白基因和蠶絲心蛋白基因轉(zhuǎn)化陸地棉研究了它們對(duì)棉花纖維品質(zhì)的影響。獲得9個(gè)克隆的25個(gè)陽(yáng)性單株，對(duì)這些株系后代進(jìn)行PCR檢測(cè)、卡那霉素檢測(cè)、GUS化學(xué)組織檢測(cè)分析，選育出5個(gè)的轉(zhuǎn)ker基因純合株系、4個(gè)的

7、轉(zhuǎn)fib純系和2個(gè)的轉(zhuǎn)ker+fib純系。Southern雜交表明，外源fib和ker基因已經(jīng)整合進(jìn)棉花基因組中，目的基因多以單拷貝或低拷貝的形式插入。Northern雜交表明外源基因fib和ker在轉(zhuǎn)基因棉花中已經(jīng)穩(wěn)定表達(dá)。定量PCR結(jié)果這些株系在開花后15d的纖維中目的基因表達(dá)量高低不同。對(duì)fib和ker基因進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析，兩個(gè)基因在0d開始表達(dá)，15-20d表達(dá)量最高，25d明顯降低。這與GAE6-3A棉纖維特異表達(dá)的

8、啟動(dòng)子啟動(dòng)的基因在15-22d優(yōu)勢(shì)表達(dá)是一致的。轉(zhuǎn)基因棉纖維扭曲度比對(duì)照明顯增加，纖維轉(zhuǎn)曲的螺距越小，轉(zhuǎn)曲度越大，單位長(zhǎng)度的轉(zhuǎn)曲數(shù)越多。棉纖維品質(zhì)檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)ker基因棉花的棉纖維的絨長(zhǎng)變短、馬克隆值增大、伸長(zhǎng)率增加，而比強(qiáng)度有的增加，有的降低。轉(zhuǎn)fib基因棉花對(duì)棉纖維的長(zhǎng)度、比強(qiáng)度、馬克隆值和伸長(zhǎng)率也有影響。轉(zhuǎn)ker+fib棉花纖維品質(zhì)發(fā)生改變，株系2-1-fk主要體現(xiàn)在比強(qiáng)度增加，株系9-2-fk體現(xiàn)在長(zhǎng)度變短，比強(qiáng)

9、度和伸長(zhǎng)率增加。相關(guān)性分析結(jié)果表明ker基因在15DPA的表達(dá)量和纖維螺距呈顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.871*，p＞0.05)，即是ker基因的表達(dá)量越低，纖維螺距越長(zhǎng)。轉(zhuǎn)ker基因的纖維螺距和棉纖維伸長(zhǎng)率的相關(guān)系數(shù)是-0.946** (p＞0.01)，呈顯著負(fù)相關(guān)，即是纖維螺距越長(zhǎng)，伸長(zhǎng)率越小。說(shuō)明ker基因在纖維中的表達(dá)使得纖維發(fā)生扭曲，纖維螺距變小，轉(zhuǎn)曲數(shù)增加，進(jìn)而纖維伸長(zhǎng)率增加，長(zhǎng)度變短，馬克隆值增加。由此可見，ker和fib基因