5-氨基水楊酸對急性百草枯中毒治療作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、百草枯(paraquat，PQ)，又名克蕪綜或?qū)Σ菘?，其化學(xué)名稱為1-1-二甲基-4-4-聯(lián)吡啶陽離子鹽，是一種廣譜、高效、環(huán)境污染較小的除草劑，在全球140余個(gè)國家得到了廣泛應(yīng)用。但是，伴隨PQ的應(yīng)用所產(chǎn)生的中毒事件常見報(bào)道。近年來，我國因PQ中毒或死亡事件呈現(xiàn)上升趨勢。PQ中毒已經(jīng)成為急診醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域所面臨的重大問題之一。
　　PQ可經(jīng)胃腸道、皮膚、呼吸道和腹腔等吸收，引起肺、肝、腎、心以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多臟器損傷，其中肺臟是

2、PQ中毒的最重要的靶器官，因肺內(nèi)存在聚胺類物質(zhì)攝取系統(tǒng)使得PQ在肺組織中異常聚集而引起嚴(yán)重的肺損傷，主要表現(xiàn)為間質(zhì)內(nèi)水腫、白細(xì)胞浸潤、肺泡充血，成纖維細(xì)胞增殖以及膠原沉積增加。上述損傷最終可能導(dǎo)致死亡，存活者可遺留長期的肺功能障礙。因PQ作用機(jī)制復(fù)雜且不明了，故目前尚無特效解毒藥，臨床上對百草枯的治療困難重重，療效多不佳。因此，深入探討其中毒機(jī)制及治療策略，尤其是針對其引起的肺損傷的研究是中毒領(lǐng)域研究中的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　在由多種

3、細(xì)胞因子以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路形成的參與肺損傷及纖維化的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中，TGF-β1/Smads是重要的調(diào)節(jié)因子，有研究提出針對TGF-β信號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行治療有望緩解PQ引起的臟器的纖維化。近年來研究表明，PPARγ激動(dòng)劑可以阻斷TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)而抑制主要臟器的慢性纖維化進(jìn)程。5-氨基水楊酸(5-ASA)是最經(jīng)典的抗炎劑，可以作為PPARγ的配體直接結(jié)合并激活PPARγ，進(jìn)而影響TGF-β信號(hào)通路活性而發(fā)揮作用。目前有關(guān)PPARγ在百草枯引

4、起的肺損傷中所起的作用，以及5-ASA在PQ中毒的治療作用少見報(bào)道。
　　鑒于此，本研究通過建立PQ中毒大鼠模型，從整體水平上觀察PQ對大鼠急性肺臟損傷及氧化應(yīng)激的作用;PQ對大鼠肺組織纖維化以及PPARγ、TGF-β1、P-Smad3的表達(dá)的影響;同時(shí)觀察5-ASA在上述過程中的治療作用。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過體外實(shí)驗(yàn)觀察5-ASA在PQ對WI38VA13細(xì)胞PPARγ、TGF-β1、P-Smad3的表達(dá)的影響。旨在揭示PPAR

5、γ在百草枯引起的急性肺損傷及肺纖維化過程中的作用以及5-ASA對百草枯中毒的治療作用。
　　第一部分、5-ASA對PQ染毒大鼠肺組織的保護(hù)性抗損傷作用
　　目的:探討5-ASA對PQ染毒大鼠肺組織的炎性損傷是否有保護(hù)作用。
　　方法:成年雄性Wister大鼠共125只，隨機(jī)分為5組。對照組（空白對照組，Control組）給予蒸餾水灌胃，5-ASA組按75mg/kg灌胃，PQ組按80mg/kg灌胃，PQ+30mg5-AS

6、A組按PQ80mg/kg+5-ASA30mg/kg灌胃，PQ+75mg5-ASA組按PQ80mg/kg+5-ASA75mg/kg灌胃。分別于試驗(yàn)開始后24h、72h、7d、14d、28d分批處死動(dòng)物，每組5只，留取靜脈血及肺組織待檢。計(jì)算肺系數(shù)，測定血清中SOD、GSH、MDA含量。同時(shí)留取部分肺組織做病理切片，行HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理改變。
　　結(jié)果:
　　1.染毒及干預(yù)后各組大鼠的一般狀況觀察PQ組大鼠在

7、染毒后2h即可出現(xiàn)明顯的中毒表現(xiàn)，且在1～3天最明顯，具體表現(xiàn)為:①一般情況:精神較差、倦怠、嗜睡、煩躁、易激惹、口鼻及眼周血性分泌物、豎毛、體重減輕、下降程度最大的一只達(dá)46g，進(jìn)食水明顯減少;②呼吸系統(tǒng)表現(xiàn):呼吸急促、呼吸困難、腹式呼吸、口周紫紺，嚴(yán)重者可以聽到喘鳴音;③消化系統(tǒng):厭食水，稀便等;④泌尿系統(tǒng):少尿或無尿，血尿等。PQ+30mg5-ASA組和PQ+75mg5-ASA組（染毒+治療組）:大鼠經(jīng)5-ASA治療后，中毒表現(xiàn)較

8、PQ組為輕，但不同劑量5-ASA兩個(gè)治療組之間沒有明顯差別。
　　2.染毒及干預(yù)后各組大鼠的大體病理學(xué)變化觀察PQ組染毒早期(24h、72h、7d)可見雙肺體積明顯增大、充血、水腫、有點(diǎn)片狀出血，部分大鼠胸腔有血性滲出物，胃腸道可見明顯脹氣、充血，粘膜可見散在出血點(diǎn)及潰瘍;肝臟充血、腫脹，雙腎腫大，顏色紫紅，被膜緊張，偶可見出血點(diǎn)。染毒晚期(14d，28d)可見雙肺表面不平，散在陳舊出血點(diǎn)，有點(diǎn)片狀白色，偏僵硬感。PQ+30mg5

9、-ASA組和PQ+75mg5-ASA組染毒早期各臟器病變表現(xiàn)均較PQ組為輕，雙肺出血不明顯，晚期雙肺表面較光滑，有點(diǎn)片狀白色區(qū)域，但明顯少于PQ組。兩個(gè)治療組區(qū)別不明顯。
　　綜上可見5-ASA治療可以改善PQ中毒引起的大體病理變化，且兩種劑量無明顯差別。
　　3.相對體重的比較給予75mg5-ASA組各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相對體重隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間逐漸上升，與對照組相比無明顯差異(P＞0.05)。PQ染毒后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重下降，明顯低于對照組，7

10、2h時(shí)達(dá)到高峰(P＜0.05)，染毒14d時(shí)恢復(fù)至與對照組相同水平(P＞0.05)。PQ+30mg和75mg5-ASA組動(dòng)物72小時(shí)內(nèi)相對體重也有下降，明顯低于對照組和5-ASA組（P＜0.05）;但7d時(shí)即可恢復(fù)至對照組和5-ASA組水平(P＞0.05)。提示5-ASA治療可以減輕PQ中毒對大鼠體重的影響，側(cè)面反映其可減輕PQ的毒性反應(yīng)。
　　4.肺系數(shù)的比較5-ASA組動(dòng)物處理各時(shí)間段肺系數(shù)無明顯變化，與對照組無明顯差異（P＞

11、0.05）。PQ染毒后肺系數(shù)明顯上升，至第7d升至高峰，14天時(shí)較第7d下降，但28d時(shí)再次升高，呈雙相升高表現(xiàn)。各時(shí)間段肺系數(shù)均明顯高于對照組和5-ASA組(P＜0.05)。PQ+30mg5-ASA組和PQ+75mg5-ASA組動(dòng)物24h和72h肺系數(shù)與對照組和5-ASA組相比均有明顯增加，尤以72h時(shí)升高明顯（P＜0.05），但兩個(gè)治療組24h和72h肺系數(shù)及其后各時(shí)間點(diǎn)肺系數(shù)均明顯低于PQ組（P＜0.05），且恢復(fù)至與對照組和5-

12、ASA組同一水平的時(shí)間均明顯短于PQ組(7d vs28d)。但兩治療組之間相比無明顯差異（P＞0.05）。
　　綜上表明，5-ASA治療組肺系數(shù)明顯較中毒組輕，說明5-ASA在一定程度上減輕了PQ中毒引起的充血水腫。
　　5.血清學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果5-ASA組各時(shí)間點(diǎn)血清SOD、GSH、MDA含量與對照組相比無明顯差異(P＞0.05)，染毒后PQ組血清SOD、GSH活力明顯下降，SOD活力在7d前均明顯低于對照組和5-ASA組(

13、P＜0.05)，以72h降低最明顯，GSH含量在14d前均明顯低于對照組和5-ASA組(P＜0.05)，以14d時(shí)含量最低，MDA含量則在染毒后呈上升趨勢，7d前均較對照組和5-ASA組明顯升高(P＜0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)三個(gè)血清學(xué)指標(biāo)均與對照組和5-ASA組相比無明顯差異（P＞0.05）。而兩個(gè)治療組血清學(xué)指標(biāo)變化趨勢與PQ組相一致，但程度均低于PQ組，SOD活力僅在72h時(shí)下降，與PQ組，對照組和5-ASA組相比均有顯著差異(P＜0

14、.05)，GSH含量僅24h時(shí)與對照組和5-ASA組相比有顯著差異(P＜0.05)，24h～14d內(nèi)均明顯高于PQ組(P＜0.05); MDA含量在72h后逐漸下降，PQ+30mg5-ASA組在各時(shí)間段與對照組和5-ASA組相比均無顯著差異(P＞0.05)，72h和7d時(shí)明顯低于PQ組(P＜0.05); PQ+75mg5-ASA組在24h時(shí)明顯高于對照組和5-ASA組(P＜0.05)，其在各時(shí)間段與PQ組相比均無顯著差異(P＞0.05)

15、。結(jié)果表明PQ中毒早期會(huì)出現(xiàn)SOD、GSH含量下降和MDA含量上升，5-ASA治療使這些變化在持續(xù)時(shí)間和程度上都有所減輕。
　　6.肺組織病理改變(HE染色)5-ASA組動(dòng)物肺組織結(jié)構(gòu)與對照組無明顯差異，鏡下可見肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺泡間隔無增寬及充血，肺泡腔無炎性細(xì)胞浸潤及出血現(xiàn)象。PQ染毒后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織出現(xiàn)明顯肺泡炎改變，24h可見肺內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張、瘀血，氣管及血管周圍有不同程度的水腫，72h、7d時(shí)

16、肺間質(zhì)和肺泡水腫繼續(xù)進(jìn)展，7d時(shí)達(dá)高峰，病變范圍超過75％，肺泡間隔充血、增厚，肺泡腔變窄，部分肺泡腔充滿粉染均質(zhì)水腫液，可伴廣泛血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，彌漫性肺出血，部分有透明膜形成，肺泡腔內(nèi)有游離的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，14d和28d炎癥改變逐漸減輕，炎性細(xì)胞浸潤以巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞為主，并有少量淋巴細(xì)胞，仍有出血及水腫，肺間隔明顯增寬，組織增生明顯，可見膠原纖維增生。
　　PQ+30mg5-ASA組和PQ+75mg5-ASA組實(shí)

17、驗(yàn)動(dòng)物肺組織病變較輕，肺泡內(nèi)充血水腫和炎性細(xì)胞浸潤程度低于PQ組，病變范圍低于60％，后期膠原纖維增生亦較PQ組為輕。
　　提示:5-ASA的治療減輕了PQ中毒引起的肺的早期以肺泡炎和晚期以增生和纖維化為主要表現(xiàn)的病理變化。
　　第二部分、5-ASA對PQ引起的肺纖維化的保護(hù)作用
　　目的:TGF-β1/Smads信號(hào)途徑是肺纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，本部分研究目的旨在探討作為PPARγ激動(dòng)劑，5-ASA是否能通過抑制TG

18、F-β1/Smads信號(hào)途徑，進(jìn)而減輕PQ中毒引起的肺纖維化。
　　方法:實(shí)驗(yàn)分組與處理同第一部分，留取肺組織測HYP含量，肺組織進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察及VG染色。免疫組化法檢測PPARγ、TGF-β1在肺中的表達(dá)，蛋白免疫印跡測定P-smad3水平。
　　結(jié)果:
　　1.肺組織HYP含量測定結(jié)果5-ASA組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物各時(shí)間點(diǎn)肺組織HYP水平與對照組無明顯差異(P＞0.05)。PQ組于染毒后第7d實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織HYP含量開始

19、升高，7d、14d、28d均顯著高于對照組和5-ASA組（P＜0.05）。給予5-ASA治療后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織HYP水平升高時(shí)間延后至第14d，與對照組和5-ASA組相比14d和28d時(shí)肺組織HYP含量增高，但兩組動(dòng)物肺組織HYP水平均明顯均低于PQ組。結(jié)果表明HYP含量升高發(fā)生在PQ中毒后期，5-ASA的治療使其升高的時(shí)間延后，程度減輕。
　　2.Van Gieson膠原纖維染色Van Gieson膠原纖維染色可見對照組和5-AS

20、A組肺組織僅在大支氣管壁、血管周圍及肺泡間隔區(qū)見少量紅色的膠原纖維。PQ染毒早期(24h、72h、7d)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織未見明顯膠原纖維增生，但染毒14d以后膠原纖維著色明顯增強(qiáng)，血管壁與支氣管壁的內(nèi)皮下與肌層下均有紅染的膠原纖維出現(xiàn)，肺泡間隔呈纖維性增厚，部分區(qū)域膠原纖維不規(guī)則排列。
　　PQ+30mg5-ASA組和PQ+75mg5-ASA組動(dòng)物染毒24h至14d時(shí)未見明顯膠原纖維增生;僅在染毒28d時(shí)可見膠原纖維數(shù)量多于對照組，

21、但較染毒組明顯減輕，有部分肺泡間隔增厚。結(jié)果提示5-ASA的治療減少了膠原纖維的合成。
　　3.PPARγ和TGF-β1的免疫組織化學(xué)結(jié)果
　　3.1 PPARγ在大鼠肺組織中的表達(dá)與分布免疫組化染色結(jié)果表明，PPARγ免疫反應(yīng)產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒狀，胞質(zhì)很少著色，正常組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織內(nèi)可見PPARγ表達(dá)陽性的血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。給予5-ASA后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織PPARγ陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)，7天

22、時(shí)達(dá)高峰(1.61±0.06)，與用藥時(shí)間相一致，較其他組明顯升高（P＜0.05）。14天后PPARγ表達(dá)水平下降，恢復(fù)至對照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物水平(P＞0.05)。PQ染毒后肺組織內(nèi)PPARγ表達(dá)陽性的血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均明顯減少，尤以PQ染毒7d時(shí)最明顯（0.44±0.07），14d之前與對照組相比均有顯著差異(P＜0.05)。至染毒28d時(shí)恢復(fù)至正常水平。5-ASA治療組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織PPARγ表達(dá)陽性的細(xì)胞較對照組減少

23、，但較PQ組多，如7d時(shí)染色指數(shù)分別為0.59±0.07、0.61±0.06，在14d之前與兩組相比均有明顯差異(P＜0.05)。28d時(shí)恢復(fù)至正常水平。提示PQ使PPARγ表達(dá)下調(diào)，而5-ASA使這種作用減弱。
　　3.2 TGF-β11在大鼠肺組織中的表達(dá)與分布免疫組化染色結(jié)果表明，TGF-β1表達(dá)定位于細(xì)胞胞漿，主要表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及散在的炎性細(xì)胞。PQ組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒后TGF-β1表達(dá)明顯增強(qiáng)，至

24、14d時(shí)達(dá)高峰（0.976±0.063），各時(shí)間點(diǎn)染色指數(shù)均明顯高于對照組(P＜0.05)。28d時(shí)恢復(fù)至正常水平。
　　PQ+30mg5-ASA組和PQ+75mg5-ASA組:TGF-β1表達(dá)于染毒后增多，但染色指數(shù)介于對照組和PQ組之間，于7d時(shí)達(dá)高峰(0.557±0.078，0.612±0.056)，與前兩組相比均有顯著差異(P＜0.05)。28d時(shí)回落至正常。
　　由上可見5-ASA的治療抑制了由于PQ中毒引起的肺內(nèi)

25、TGF-β1的表達(dá)上調(diào)。
　　4.肺組織中P-smad3的免疫蛋白印跡結(jié)果5-ASA組動(dòng)物肺組織p-smad3蛋白表達(dá)在各時(shí)間段無明顯變化，與對照組相比無明顯差異(P＞0.05)。PQ染毒后P-smad3蛋白表達(dá)逐漸上升，14d時(shí)達(dá)高峰（0.688±0.065），28d時(shí)下降，但仍高于正常水平，各時(shí)間點(diǎn)P-smad3蛋白表達(dá)均明顯高于對照組(P＜0.05)。PQ+30mg5-ASA組和PQ+75mg5-ASA組:P-smad3蛋白

26、表達(dá)水平于染毒后升高，但介于對照組和PQ組之間，7d時(shí)達(dá)高峰（0.349±0.021，0.347±0.027），之后下降，14d前與兩組差異均有意義(P＜0.05)。28d時(shí)回落至正常水平(P＞0.05)。結(jié)果表明PQ染毒后肺內(nèi)smad3蛋白磷酸化水平上升，5-ASA的應(yīng)用抑制了PQ的這種作用。
　　第三部分、5-ASA對WI38VA13細(xì)胞PPARγ、TGF-β1、P-Smad3的表達(dá)的影響
　　目的:了解PQ是否對于成纖

27、維細(xì)胞的TGF-β1、P-Smad3的分泌產(chǎn)生影響，及應(yīng)用5-ASA后是否對TGF-β1/Smads信號(hào)通路的傳導(dǎo)有調(diào)控作用。
　　方法:用MTT法確定試驗(yàn)用PQ濃度，Western Blot方法檢測PQ、5-ASA、PQ+5-ASA處理WI38VA13細(xì)胞后，在12h、24h和48h時(shí)細(xì)胞中PPARγ、TGF-β1、 P-Smad3含量。
　　結(jié)果:
　　1.PQ對WI38VA13細(xì)胞存活率的影響PQ對WI38VA1

28、3細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用。經(jīng)PQ處理24h后，200、250、300、400、600、800、1000μmol/L PQ處理組WI38VA13細(xì)胞存活率均明顯低于對照組(P＜0.05)。在200-1000μmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著PQ濃度的升高，WI38VA13細(xì)胞的存活率明顯降低。
　　2.5-ASA對PQ作用下WI38VA13細(xì)胞中PPARγ、TGF-β1、P-Smad3的影響
　　2.1 5-ASA對PQ作用下W

29、I38VA13細(xì)胞PPARγ表達(dá)的影響Western Blot檢測結(jié)果顯示，給予5-ASA處理后，WI38VA13細(xì)胞中PPARγ蛋白表達(dá)與對照組相比增強(qiáng)，各時(shí)間組與對照組相比均有明顯差異(P＜0.05)。單純給予PQ處理，WI38VA13細(xì)胞中PPARγ蛋白表達(dá)與對照組相比明顯下降，并隨時(shí)間延長遞減，各時(shí)間組與對照組相比均有明顯差異(P＜0.05)。5-ASA與PQ共同處理組，WI38VA13細(xì)胞中PPARγ蛋白與對照組相比表達(dá)下降，

30、但介于5-ASA組與PQ組之間，與兩組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示PQ下調(diào)了WI38VA13細(xì)胞中PPARγ蛋白的表達(dá)，而5-ASA則有上調(diào)作用，共同作用下，5-ASA可以部分的逆轉(zhuǎn)PQ對WI38VA13細(xì)胞中PPARγ蛋白表達(dá)的下調(diào)作用。
　　2.2 5-ASA對PQ作用下WI38VA13細(xì)胞TGF-β1表達(dá)的影響Western Blot檢測結(jié)果顯示，給予5-ASA處理后，WI38VA13細(xì)胞中TGF-β1蛋白表達(dá)與

31、對照組相比無明顯差異(P＞0.05)，PQ處理后，TGF-β1蛋白表達(dá)與對照組相比明顯增強(qiáng)，并隨時(shí)間延長遞增，與對照組相比有明顯差異(P＜0.05)。5-ASA與PQ共同處理組，TGF-β1蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，數(shù)值介于PQ組和對照組之間，與兩組相比均有明顯差異(P＜0.05)。提示PQ激活WI38VA13細(xì)胞中TGF-β1蛋白表達(dá)，5-ASA可以部分逆轉(zhuǎn)PQ對WI38VA13細(xì)胞中TGF-β1蛋白表達(dá)的上調(diào)作用。
　　2.3 5-A

32、SA對PQ作用下WI38VA13細(xì)胞P-Smad3表達(dá)的影響Western Blot檢測結(jié)果顯示，給予5-ASA處理后，WI38VA13細(xì)胞中Smad3蛋白磷酸化水平與對照組相比無明顯差異(P＞0.05)，PQ處理后，Smad3蛋白磷酸化水平與對照組相比明顯增強(qiáng)，并隨時(shí)間延長遞增，與對照組相比有明顯差異(P＜0.05)。5-ASA與PQ共同處理組，Smad3蛋白磷酸化逐漸增強(qiáng)，數(shù)值介于PQ組和對照組之間，與兩組相比均有明顯差異(P＜0.

33、05)。提示PQ作用后，WI38VA13細(xì)胞中Smad3蛋白磷酸化水平上調(diào)，5-ASA可以部分逆轉(zhuǎn)PQ對WI38VA13細(xì)胞中Smad3蛋白磷酸化水平的上調(diào)作用。
　　結(jié)論:
　　1.PQ灌胃染毒是建立急性肺損傷和肺纖維化動(dòng)物模型的可靠方法，為研究PQ中毒機(jī)制及藥物療效奠定了基礎(chǔ)。
　　2.氧自由基的產(chǎn)生在PQ中毒所致肺損傷中起重要作用，表現(xiàn)為染毒后脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量的升高，抗氧化物質(zhì)SOD、GSH含量的下降。<

34、br>　　3.TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在PQ引起的大鼠肺纖維化中發(fā)揮重要作用。
　　4.PQ處理可以引起WI38VA13細(xì)胞TGF-β1以及P-Smad3表達(dá)增強(qiáng)。
　　5.5-ASA有抗自由基及減輕脂質(zhì)過氧化作用，對PQ引起的肺損傷有一定的保護(hù)性抗炎作用。
　　6.5-ASA作為PPARγ配體，通過干預(yù)TGF-β1/Smads信號(hào)通路一定程度上緩解PQ導(dǎo)致的肺纖維化。
　　7.5-ASA可以逆轉(zhuǎn)PQ