p53、MDM2基因及其多態(tài)與稽留流產(chǎn)的關(guān)系研究.pdf

1、稽留流產(chǎn)是指在妊娠20周前，在沒有任何外界干預(yù)因素的情況下，胚胎或胎兒在宮內(nèi)死亡后未及時排出。造成稽留流產(chǎn)的原因很多，如染色體的數(shù)量、結(jié)構(gòu)異常，免疫功能不全，內(nèi)分泌功能紊亂，子宮內(nèi)環(huán)境異常，遺傳性血栓形成傾向，全身感染性疾病，環(huán)境不良因素，這些因素大約占稽留流產(chǎn)發(fā)病原因的50％。稽留流產(chǎn)的發(fā)生可能是多因素共同作用的結(jié)果，但是確切機制尚不明確。 p53蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)多個基因的表達，在細胞周期的調(diào)控，維持細胞基因組的完整

2、性，誘導(dǎo)細胞分化和凋亡過程中起著重要的作用。在正常細胞，p53基因的功能保持在較低水平，從而使細胞周期不中斷或細胞不會遭受最終的死亡。當(dāng)細胞的DNA受到損傷，適當(dāng)?shù)膒53基因介導(dǎo)的細胞修復(fù)途徑被激活；如果過多的損害使修復(fù)不能順利進行，則p53介導(dǎo)的凋亡途徑開始起作用，從而導(dǎo)致細胞凋亡，細胞周期停滯在G1期。有研究表明滋養(yǎng)層細胞凋亡相關(guān)因素p53蛋白的表達與稽留流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)。p53蛋白是一種短壽命蛋白，其細胞內(nèi)濃度受其負調(diào)控因子鼠雙微體

3、基因2（MDM2）基因的嚴(yán)格調(diào)控。MDM2是p53調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的下游基因，作為p53的重要調(diào)節(jié)因子參與細胞的生長、凋亡、細胞周期調(diào)控等過程。通過對包含p53和MDM2的負反饋回路的研究發(fā)現(xiàn)，野生型p53蛋白的高表達能刺激MDM2蛋白的表達升高；然而，增加的MDM2蛋白又能夠抑制野生型p53蛋白的功能，從而增加了負反饋循環(huán)的作用。能夠影響到p53、MDM2或p53-MDM2相互作用的因素都會對細胞命運（凋亡、細胞周期阻滯等）產(chǎn)生重要影響。

4、 基于p53、MDM2基因多態(tài)及p53、MDM2基因在調(diào)控細胞凋亡、改變細胞周期和血管生成中起著重要的作用，我們將研究分為兩部分，第一部分主要探討早孕患者血液及絨毛組織p53 codon72和MDM2 SNP309的基因多態(tài)分型及絨毛組織中p53 codon72和MDM2 SNP309的基因多態(tài)與p53、MDM2基因表達的關(guān)系；第二部分檢測絨毛組織中p53、MDM2、VEGF和HIF-1α基因的表達，進而通過將重組質(zhì)粒pcDNA3

5、-MDM2轉(zhuǎn)染入絨毛滋養(yǎng)細胞株JEG-3、Bewo，研究p53、MDM2基因在絨毛滋養(yǎng)細胞生長過程中的作用機制，闡明稽留流產(chǎn)的發(fā)病原因，從而為稽留流產(chǎn)的早期診治提供新的策略。 第一部分： p53、MDM2基因多態(tài)與稽留流產(chǎn)的關(guān)系研究 [研究目的]： （1）探討p53 codon72和MDM2 SNP309基因多態(tài)在稽留流產(chǎn)及人工流產(chǎn)患者血液和絨毛組織中的分型，試圖發(fā)現(xiàn)與稽留流產(chǎn)發(fā)生有關(guān)的高危基因型。 （2）

6、探討絨毛組織中p53 codon72和MDM2 SNP309基因多態(tài)與p53、MDM2基因表達的關(guān)系，進而明確多態(tài)等位基因的作用原理。 [研究方法]： （1）DNA提取試劑盒提取稽留流產(chǎn)和人工流產(chǎn)患者血液和絨毛組織中的DNA。 （2）序列特異性引物多聚酶鏈反應(yīng)（PCR-SSP）分析稽留流產(chǎn)和人工流產(chǎn)患者血液及絨毛組織中p53 codon72的多態(tài)基因分型。 （3）限制性片段長度多態(tài)性多聚酶鏈反應(yīng)（PCR-RFL

7、P）分析稽留流產(chǎn)和人工流產(chǎn)患者血液及絨毛組織中MDM2 SNP309的多態(tài)基因分型。 （4）提取稽留流產(chǎn)和人工流產(chǎn)患者絨毛組織mRNA，通過實時熒光定量PCR（qReal-time PCR）檢測絨毛組織中p53與MDM2基因mRNA的表達。 （5）免疫組織化學(xué)方法檢測稽留流產(chǎn)和人工流產(chǎn)患者絨毛組織中p53、MDM2蛋白的定位及表達。 [結(jié)果]： （1）血液及絨毛組織中p53 codon72多態(tài)基因分型：p53

8、codon72 Pro/Pro基因型在稽留流產(chǎn)組中的發(fā)生比例明顯高于人工流產(chǎn)組（9.47％ vs.3.66％；20.00％ vs.12.5％），但是兩組比較，差別沒有顯著性（P＝0.094； P=0.330）。p53 codon72 Arg/Arg基因型在稽留流產(chǎn)組中的發(fā)生比例低于人工流產(chǎn)組（34.74％ vs.37.80％；20.00％ vs.25.00％），但是兩組比較，差別沒有顯著性（P＝0.689； P＝0.528）。 （

9、2）血液及絨毛組織中MDM2 SNP309 G/G基因多態(tài)分型：MDM2 SNP309 G/G基因型在稽留流產(chǎn)組中的發(fā)生比例明顯高于人工流產(chǎn)組（32.63％vs.18.29％；28.33％vs.12.50％），并且兩組比較，差別有顯著性（P=0.010；P＝0.043）。 （3）絨毛組織中p53 mRNA表達情況比較。 （4）p53蛋白在絨毛組織中的定位及表達。 （5）絨毛組織中MDM2 mRNA表達情況比較。

10、（6）MDM2蛋白在絨毛組織中的定位及表達。 [結(jié)論]： （1）MDM2 SNP309 G/G基因型是稽留流產(chǎn)發(fā)生的高?；蛐?。 （2）p53 codon72 Pro/Pro基因型和MDM2 SNP309 G/G基因型能夠誘導(dǎo)MDM2基因的高表達，最終導(dǎo)致稽留流產(chǎn)的發(fā)生。 第二部分： p53、MDM2基因在稽留流產(chǎn)中的作用機制研究 [研究目的]： （1）探討p53、MDM2、血管內(nèi)皮生長因子（

11、VEGF）和缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）在稽留流產(chǎn)和人工流產(chǎn)患者絨毛組織中mRNA的表達與蛋白的表達及定位。 （2）探討p53、MDM2基因在絨毛滋養(yǎng)細胞生長過程中的作用機制。 [研究方法]： （1）qReal-time PCR檢測稽留流產(chǎn)和人工流產(chǎn)患者絨毛組織中p53、MDM2、VEGF和HIF-1α基因mRNA的表達。 （2）免疫組織化學(xué)方法檢測稽留流產(chǎn)和人工流產(chǎn)患者絨毛組織中p53、MDM2、VEG

12、F和HIF-1α蛋白的表達及定位。 （3）提取JEG-3、Bewo細胞的mRNA，擴增MDM2基因，鑒定兩種細胞株的MDM2 mRNA的表達情況。 （4）將質(zhì)粒pcDNA3和重組質(zhì)粒pcDNA3-MDM2分別轉(zhuǎn)染入絨毛滋養(yǎng)細胞株JEG-3和Bewo中，經(jīng)G418篩選，用反轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-PCR）法檢測MDM2mRNA的表達，篩選出高表達的細胞株。 （5）將篩選成功的細胞株給予MDM2的拮抗劑（Nutlin3）處理，

13、置于乏氧（1％O2；5％CO2；94％ N2）條件下培養(yǎng)。JEG-3細胞株分為五組：A組：JEG-3組；B組：JEG-3-pcDNA3-DMSO組；C組：JEG-3-pcDNA3-Nutlin3組；D組：JEG-3-pcDNA3-MDM2-DMSO組； E組：JEG-3-pcDNA3-MDM2-Nutlin3組（Bewo細胞株的分組方法同JEG-3細胞株）。培養(yǎng)24小時后收集以上各組細胞： 1）收集5×105細胞加入1ml4℃

14、預(yù)冷的70％的乙醇-PBS溶液吹打成單細胞懸液，置于4度冰箱過夜。經(jīng)PI處理后，流式細胞儀檢測各組細胞的細胞周期改變； 2）剩余細胞分為兩部分，分別用qReal-time PCR和免疫印跡（Western blotting）法檢測各組細胞p53、MDM2、VEGF和HIF-1α的mRNA和蛋白質(zhì)表達。 [結(jié)果]： （1）稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中p53、MDM2、VEGF和HIF-1αmRNA表達的相關(guān)性結(jié)果。

15、（2）人工流產(chǎn)患者絨毛組織中p53、MDM2、VEGF和HIF-1α mRNA表達的相關(guān)性。 （3）稽留流產(chǎn)和人工流產(chǎn)患者絨毛組織中p53、MDM2、VEGF和HIF-1α蛋白的定位。 （4）稽留流產(chǎn)和人工流產(chǎn)患者絨毛組織中p53、MDM2、VEGF和HIF-1α蛋白表達情況的比較。 （5）JEG-3細胞株有MDM2 mRNA的弱表達，Bewo細胞株無MDM2 mRNA的表達。 （6）流式細胞儀檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)。

16、 （7）乏氧條件下培養(yǎng)的JEG-3各組細胞p53、MDM2、VEGF和HIF-1α mRNA表達水平的檢測。 （8）乏氧條件下培養(yǎng)的Bewo各組細胞p53、MDM2、VEGF和HIF-1α mRNA表達水平的檢測。 （9）乏氧條件下培養(yǎng)的JEG-3各組細胞p53、MDM2、VEGF和HIF-1α蛋白表達水平的檢測。 （10）乏氧條件下培養(yǎng)的Bewo各組細胞p53、MDM2、VEGF和HIF-1α蛋白表達水平的檢測