化學修飾siRNA的設計、合成及其生物活性研究.pdf

1、siRNA（ShortinterferingRNA，siRNA）干擾技術作為一種新型的基因沉默技術，因其具有高效、高特異性、低毒性等優(yōu)點，應用siRNA干擾技術開發(fā)新型的靶向藥物，已成為藥物研究領域中重點發(fā)展方向之一。近年來，已經證實Argonaute蛋白（Ago蛋白）是RNA誘導基因沉默復合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)中關鍵的調控蛋白之一，在RNA干擾途徑中，參與siRNA的識別、解鏈以及催化

2、切割mRNA等功能，對靶基因沉默作用起關鍵調節(jié)作用。本論文是針對Ago蛋白與siRNA分子的協同作用機制，基于Ago蛋白的晶體結構，采用計算機輔助設計、熒光素酶活性篩選等研究方法，系統地研究化學修飾位點、修飾單體以及修飾組合與生物活性之間的關系，由此篩選出具有顯著基因沉默作用的siRNA化學修飾組合，并且應用該修飾技術，利用前期研究已發(fā)現的高特異沉默作用的MDM2-siRNA序列，對化學修飾MDM2-siRNA進行了體外生物活性篩選。由

3、此初步建立新型的siRNA化學修飾技術，并同時獲得高特異性、高活性、高穩(wěn)定性的化學修飾的MDM2-siRNA。
　　 一、FANA化學修飾位點與生物活性的研究
　　 針對Ago蛋白與siRNA協同引起基因沉默作用的特點，選擇特異性抑制病毒生長的5種不同靶基因siRNA序列，利用2'-脫氧-2'-氟-b-D-阿拉伯糖核苷酸(2'-Deoxy-2'-fluoro-b-D-arabinonucleicacid，FANA)修飾不

4、改變RNA螺旋構型的技術優(yōu)點，以該結構作為小分子探針，研究siRNA堿基序列不同化學修飾位點與生物活性之間的關系。生物活性檢測結果顯示：
　　 1．siRNA正義鏈、反義鏈3'末端堿基FANA修飾，均能不同程度的降低靶基因沉默作用，其中反義鏈降低的作用更為顯著。
　　 2．反義鏈3'末端以及中間位點的堿基修飾，均容易導致化學修飾siRNA活性降低，尤其反義鏈中間9～11位堿基的修飾，生物活性作用降低更為顯著。
　　

5、 3．正義鏈FANA修飾對基因沉默作用的影響相對較弱，正義鏈中間位點不同區(qū)域片段的堿基修飾，均能在不同程度上影響siRNA的活性，一般修飾后活性強弱順序如下：D區(qū)＞C區(qū)＞B區(qū)，其中D區(qū)堿基修飾可能會在一定程度上提高基因沉默作用。
　　 在本研究中，我們完成了FANA修飾單體的合成工藝探索，同時針對5種不同的靶序列，完成了44個新型化學修飾siRNA的制備，其中Ⅱ-siRNA6、Ⅱ-siRNA11以及V-siRNA3對病毒的抑制

6、作用顯著，值得進一步評價。
　　 二、Ago蛋白PAZ區(qū)的理論研究
　　 基于Ago蛋白PAZ區(qū)的晶體結構，設計了X、Y和Z共3種系列的新型化學修飾單體，利用計算機輔助藥物設計的方法，預測了PAZ區(qū)與3'末端不同化學修飾組合相互之間的結合能，初步推測其與基因沉默作用之間的關系，實驗結果顯示：
　　 1．選擇1SI2和1SI3的晶體蛋白進行骨架疊合，二者疊合結果十分理想，PAZ區(qū)的結構相對比較保守；以1SI2作為模

7、板，對siRNA與Ago蛋白的作用模式進行結構分析，數據表明siRNA的3'末端堿基可以與PAZ口袋區(qū)特異結合，適當引入疏水性基團，有利于兩者之間的相互作用。
　　 2．選擇X、Z系列的修飾單體，利用MacroModel模塊，預測和評價了3'末端不同化學修飾組合與Ago蛋白PAZ口袋區(qū)結合能量變化的趨勢，結果顯示，dTX修飾組合總結合能、范德華作用力結合能均最小。
　　 3．利用計算機輔助設計中分子疊合的方法，初步預測和

8、評價了3'末端不同的修飾組合與Ago蛋白PAZ口袋區(qū)結合后立體構型的變化狀態(tài)，實驗結果表明，相對于未修飾dTdT組合，dTX修飾組合立體構型基本保持不變，第2位疏水性基團替代嘧啶類結構，有助于芳香性疏水片段與PAZ區(qū)疏水性氨基酸殘基，通過弱的范德華作用產生靜電結合。
　　 4．新型修飾單體的化學結構，活性結合位點取代基團的電負性，以及結合作用模式等，均影響總結合能的變化，引入疏水片段能顯著降低總結合能；dTX修飾組合在空間結構上

9、與dTdT組合基本保持一致，芳香性疏水片段替代堿基更有助于降低siRNA的3'末端與PAZ區(qū)的結合能；推測dTX修飾組合將極有可能起到增強基因沉默作用的效果。
　　 三、末端修飾siRNA的研究
　　 設計并合成了X、Y和Z共3種系列的新型化學修飾單體。基于熒光素酶穩(wěn)定表達的HepG2/PGL4細胞，選擇X系列的修飾單體，采用雙熒光素酶的篩選方法，對化學修飾的siRNA進行了體外生物活性的篩選，實驗結果顯示：
　　

10、 1．相對于未修飾siRNA，化學修飾siRNA在500nM給藥劑量下，未發(fā)現明顯的細胞毒性，表現出比未修飾siRNA更低的細胞毒性。
　　 2．dTX修飾的反義鏈與不同修飾的正義鏈交叉組合，制備獲得新型化學修飾siRNAs，均能明顯增強對靶基因的沉默作用。
　　 3.3'端siRNA的化學修飾，能顯著改變siRNA的基因沉默作用，說明PAZ區(qū)與siRNA的特異識別，在基因沉默作用中可能起關鍵的調節(jié)作用,3'末端的堿基

11、是siRNA關鍵的修飾位點。
　　 4．通過生物活性的篩選，初步發(fā)現修飾組合為XdT/dTX、dTX/dTX（正義鏈／反義鏈），能顯著增強siRNA的基因沉默作用。
　　 四、化學修飾MDM2-siRNA的研究
　　 采用具有顯著增強基因沉默作用的化學修飾組合，完成了不同化學修飾MDM2-siRNA的設計、合成以及生物活性、生物穩(wěn)定性的研究，實驗結果顯示：
　　 1．前期篩選獲得的XdT/dTX、dTX/

12、dTX、以及dTX/XX等化學修飾組合，能顯著增強siRNA對腫瘤細胞MDM2的基因沉默作用。
　　 2．不同化學修飾組合的siRNA與未修飾siRNA相比，能不同程度地提高siRNA的穩(wěn)定性，其中dTX/dTX修飾組合穩(wěn)定性優(yōu)于其他修飾組合。
　　 3．篩選獲得的Ⅶ-siRNA6相對未修飾siRNA，能明顯提高基因沉默作用、穩(wěn)定性、以及體外抗腫瘤活性，其活性作用分別提高約為2、2和3倍左右，Ⅶ-siRNA6可以作為較好

13、的候選化合物，進行更深入的篩選和評價研究。
　　 以上實驗結果表明：反義鏈C區(qū)、正義鏈B區(qū)的堿基與Ago蛋白協同作用，參與siRNA的解鏈和切割的過程，這些位點FANA修飾，容易阻礙Ago蛋白對siRNA的催化解鏈功能，從而顯著降低修飾后siRNA的基因沉默作用；3'末端引入不同的化學修飾基團，能顯著影響siRNA與Ago蛋白結合和解離的能力，反義鏈3'末端化學修飾單體或修飾組合的改變，對基因沉默作用的保留或提高起關鍵作用。

14、r>　　 基于siRNA的3'末端與Ago蛋白特異結合的分子作用機制，通過Ago蛋白的理論研究和生物活性篩選的研究，初步證實理論計算的結合能與生物活性存在一定的聯系，利用結合能、結合模式的評估，可以在總體趨勢上較好的預測修飾組合與生物活性之間潛在的規(guī)律；此外，應用理論計算結果虛擬篩選獲得的幾種修飾組合，在不同靶序列的篩選上均能顯著提高基因沉默作用，該修飾組合技術具有一定的通用性；dTX/dTX化學修飾組合，能顯著提高MDM2-siRN