大麻素受體與G蛋白相偶聯(lián)的分子機制及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途經(jīng)研究.pdf

1、大麻是(Cannabis)一種古老的藥用植物，它的最早使用記錄可追溯到五千多年前．最新的研究發(fā)現(xiàn)，大麻素通過結(jié)合并激活特殊細胞表面的兩類大麻素受體CB1和CB2發(fā)揮作用．CB1受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的G蛋白偶聯(lián)受體之一，主要參與精神和行為方面的調(diào)節(jié)．相比之下，CB2受體主要表達在周邊免疫組織，參與機體的免疫應(yīng)答．因此，深入研究大麻素受體的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可以進一步闡明相關(guān)疾病發(fā)生的分子機制，為開發(fā)更有效的創(chuàng)新性治療藥

2、物提供更好的理論基礎(chǔ)和更廣闊的思路．
　　 7跨膜受體與G蛋白的選擇性偶聯(lián)主要受兩者的接觸面調(diào)控，涉及到受體的多個部位和G蛋白的各亞基．然而，迄今為止決定受體與不同G蛋白偶聯(lián)的高保真結(jié)構(gòu)決定因子仍不被我們所知．CB1受體主要通過偶聯(lián)Gs反向調(diào)節(jié)胞內(nèi)cAMP，然而多個研究發(fā)現(xiàn)CB1受體可在某些特殊條件下通過偶聯(lián)Gs介導(dǎo)胞內(nèi)cAMP的產(chǎn)生，在本研究中，我們證明CB1受體可同時偶聯(lián)到Gs提高胞內(nèi)cAMP的水平和G1介導(dǎo)ERK1/2和C

3、a2+信號的活化．相比之下，CB2受體選擇性偶聯(lián)到Gi介導(dǎo)胞內(nèi)cAMP水平的抑制．通過CB1/2嵌合體策略的運用，我們發(fā)現(xiàn)CB1受體的胞內(nèi)第二個環(huán)(ICL2)在受體與Gi和Gs選擇性偶聯(lián)方面扮演關(guān)鍵角色，而C末端在G蛋白活化幅度方面起主要作用，進一步的定點突變數(shù)據(jù)表明L222突變成AIa或Pro后導(dǎo)致CB1從G．偶聯(lián)切換到G1偶聯(lián)．然而，L222被取代成Ile或Val后導(dǎo)致受體與Gs和Gi的平衡偶聯(lián)．另外，我們注意到來自ICL2的三個堿

4、性氨基酸（H219、R220和R226）參與受體與Gs的持續(xù)性偶聯(lián)．來自GPCR-Gα復(fù)合物結(jié)構(gòu)模擬的研究揭示L222的不同突變體可導(dǎo)致局部構(gòu)象的顯著差異，由此構(gòu)成CB1與不同G蛋白選擇性偶聯(lián)的分子基礎(chǔ)，總的說來，我們第一次揭示位于高度保守域DRY(X)。L的L222介導(dǎo)CB1受體與Gx和Gi兩種在cAMP調(diào)控方面有相反效應(yīng)的G蛋白的選擇性偶聯(lián)機制，而且這種機制可能在GPCRs家族的其它成員中扮演重要角色．我們的研究為大麻素受體與G蛋白

5、偶聯(lián)及大麻素類藥物引起的耐受機制及雙向效應(yīng)提供了新見解，
　　 與CB1相比，CB2只偶聯(lián)到Gj并介導(dǎo)胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶的抑制信號。我們嘗試通過將CB2的胞內(nèi)功能面與CB1對應(yīng)的序列進行全局替換的策略達到CB2從Gi偶聯(lián)轉(zhuǎn)換到Gs偶聯(lián)的目的，來自CB2/1單嵌合體的結(jié)果表明ICL2的交換削弱受體抑制cAMP的能力并伴有本底cAMP活性的顯著提高．進一步來自CB2/1多功能域嵌合體的結(jié)果揭示ICL2和Cter的同時替換足以讓受體在激

6、動劑的處理下提高胞內(nèi)的cAMP水平，且這種效應(yīng)能被forskolin協(xié)同增強．此外，我們還將CB2受體中的P139（對應(yīng)CB1的L222）突變成A1a和Leu，發(fā)現(xiàn)P139L幾乎完全廢除受體與G1偶聯(lián)的能力，而另一突變體P139A仍能偶聯(lián)到G1但其cAMP抑制能力被適當(dāng)削弱．總體上，我們的結(jié)果顯示來自CBI受體的ICL2足以讓CB2受體獲得與Gs的親和力，而多個胞內(nèi)環(huán)間的相互作用則能充分賦予CB2受體對Gs蛋白的選擇性．此外，我們首次發(fā)

7、現(xiàn)位于DRY(X)。L保守基序中的關(guān)鍵氨基酸作為一個關(guān)鍵位點在A類G蛋白偶聯(lián)受體特異性偶聯(lián)到Gi中扮演重要角色．
　　 失敏和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運是精確調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體時間特異性和空間特異性信號的兩種重要方式．我們用融合EGFP的CB2受體研究配體誘導(dǎo)的內(nèi)吞和分選機制．大麻素激動劑WIN55，212-2可以濃度依賴和時間依賴的方式引起受體的內(nèi)吞．CB2受體的內(nèi)吞途徑主要由批有網(wǎng)格蛋白的小窩起始但不需要Gi蛋白的參與．此外，我們發(fā)現(xiàn)配體誘導(dǎo)