人參總皂苷對K562細胞增殖抑制、誘導分化的信號轉(zhuǎn)導機理的研究.pdf

1、白血病是嚴重危害人類生命健康的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，是由于造血干細胞增殖分化異常而導致的。迄今，白血病的治療仍主要采用大劑量聯(lián)合化療與放療，此療法副作用甚大，復發(fā)率高，尤其對機體免疫與造血系統(tǒng)有極大損害。在眾多的研究中，中藥以其增強免疫功能、功補兼施、毒副作用小、注意整體、應用范圍廣泛的優(yōu)越性得到了廣泛認可和重視。從祖國醫(yī)學寶庫中尋找出既能促進正常造血又能抑制白血病細胞惡性增殖的天然中藥，已成為治療白血病的希望和重要途徑。 目的：本

2、課題組前期研究已證明人參總皂苷（Total saponins of pannax ginseng，TSPG）既能促進造血干/祖細胞增殖分化及其信號轉(zhuǎn)導又能抑制白血病細胞增殖，并可誘導白血病細胞凋亡和向較成熟細胞分化，但其作用機制尚不清楚。研究表明JAK2激酶及其下游信號蛋白分子-信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）對細胞增殖抑制及定向紅系在EPO介導的信號轉(zhuǎn)導中起著重要作用。本研究采用研究信號轉(zhuǎn)導途徑的方法，選擇JAKs/STATs通路探

3、討TSPG參與造血調(diào)控的分子機制，進一步闡述TSPG調(diào)節(jié)造血細胞增殖分化的生物學機理，為發(fā)現(xiàn)與尋找TSPG調(diào)控白血病細胞增殖、分化或凋亡的分子靶點奠定基礎(chǔ)，臨床治療血液學疾病提供指導。 方法：1、采用細胞體外培養(yǎng)技術(shù)，MTT法、流式細胞術(shù)檢測TSPG對K562細胞增殖的影響；2、血紅蛋白測定（分光光度法）檢測經(jīng)TSPG誘導后K562細胞的血紅蛋白含量變化；3、免疫細胞化學技術(shù)觀察TSPG作用K562細胞后JAK2的分布；4、激光

4、共聚焦顯微鏡觀察TSPG作用K562細胞后STAT5的分布；5、實驗分組：陰性對照組，常規(guī)方法培養(yǎng)；Hemin組：常規(guī)培養(yǎng)基礎(chǔ)上加入Hemin，終濃度30μmol/L；TSPG組，常規(guī)培養(yǎng)基礎(chǔ)上加不同濃度TSPG；TSPG+AG490組：TSPG與AG490的終濃度分別是200mg/L和100μmol/L，各組K562細胞培養(yǎng)不同時間后收集細胞，Western blotting法檢測JAK2、STAT5、STAT3、STAT1及P-JA

5、K2、P-STAT5、P-STAT3的變化。 結(jié)果：1、TSPG對K562細胞的增殖有明顯的抑制作用，抑制強度與TSPG的劑量和作用時間密切相關(guān)；2、經(jīng)TSPG作用后K562細胞被阻滯在S期，且G0/G1％增加，提示TSPG作用于細胞周期使K562細胞增殖抑制；3、經(jīng)TSPG誘導后K562細胞的血紅蛋白合成量提高；4、免疫細胞化學染色：用JAK2抗體顯示K562細胞JAK2表達，可見對照組和TSPG組K562細胞胞質(zhì)呈棕褐色，J

6、AK2在上述兩組的分布無明顯差異；5、激光共聚焦掃描顯微鏡觀察顯示，K562細胞胞質(zhì)和胞核均可見STAT5熒光，TSPG200mg/L作用K562細胞24h，細胞核內(nèi)STAT5熒光強度明顯減弱；6、Western blotting結(jié)果顯示，TSPG（200mg/L）作用K562細胞24h，漿蛋白中STAT5表達較對照組增加，核蛋白中STAT5表達則減少；作用24h、48h、72h，細胞總蛋白中JAK2、STAT1、STAT3、STAT5

7、的表達無明顯變化；作用24h，STAT5酪氨酸磷酸化較對照組明顯減弱，作用48h Phospho-STAT5條帶微弱不能觀察到，而作用72h可見STAT5酪氨酸磷酸化與對照組比較無明顯差異；作用24h可見Phosphor-JAK2條帶，較對照組增強；作用48h與對照組比較STAT3酪氨酸磷酸化顯著增強，作用24h和72h Phospho-STAT3條帶微弱不能觀察到。 TSPG（200mg/L）與AG490（100μmol/L

8、）協(xié)同作用K562細胞24h、48h、72h，細胞總蛋白中JAK2、STAT1、STAT3、STAT5的表達無明顯變化；作用24h、48h Phospho-STAT5條帶微弱不能觀察到，作用72h可見Phospho-STAT5條帶，與對照組和TSPG組比較均明顯減弱；作用48h與對照組和TSPG組比較，STAT3酪氨酸磷酸化有顯著差異。 結(jié)論：TSPG在體外對K562細胞有明顯的增殖抑制作用，并能誘導其向紅系細胞分化；在JAK2