轉(zhuǎn)基因組織工程軟骨修復兔膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損.pdf

1、一研究背景及目的由創(chuàng)傷、骨關(guān)節(jié)炎等引起的關(guān)節(jié)軟骨病損是骨科常見疾患，已成為導致中老年人殘疾的主要原因。局限于軟骨淺層的缺損，依靠軟骨細胞有限的分裂能力僅有微小的內(nèi)源性修復或難以修復；全層關(guān)節(jié)軟骨缺損，由骨髓遷徙來的間充質(zhì)干細胞分化為軟骨細胞，形成的新生修復組織介于纖維軟骨和透明軟骨之間，其性能難與正常軟骨相比，逐漸出現(xiàn)退變。近年來探索應用于臨床的許多方法，如鉆孔術(shù)、關(guān)節(jié)鏡下磨削及灌洗術(shù)、自體或異體組織(骨膜、軟骨膜、骨軟骨塊等)移植、細

2、胞(軟骨細胞或間充質(zhì)干細胞)移植等，雖在近期能獲得癥狀的改善，但未能使受損的軟骨在形態(tài)學、生化和生物力學方面恢復至正常，修復組織不能達到良好的遠期療效，常在短期內(nèi)發(fā)生退變。諸多嘗試說明在接受關(guān)節(jié)置換之前尚無公認的有效手段。組織工程技術(shù)可以通過獲取自體或異體少量組織細胞，在某些細胞因子的作用下，經(jīng)體外培養(yǎng)擴增后與支架材料復合，構(gòu)建與病損區(qū)形狀結(jié)構(gòu)、生物學特性相近的細胞—支架復合體，以修復或替代損傷組織。以自體軟骨細胞為種子細胞，存在來源有

3、限，體外多次傳代培養(yǎng)易使細胞發(fā)生“去分化”，喪失分泌軟骨基質(zhì)的能力，因此難以用少量自體組織經(jīng)培養(yǎng)獲得大量有正常功能的軟骨細胞。干細胞如胚胎干細胞和骨髓基質(zhì)干細胞具有很強的分裂增殖能力及多向分化潛能，在一定條件下可以分化為軟骨細胞，但體外培養(yǎng)條件下如何誘導干細胞向軟骨細胞表型分化，以及如何維持軟骨細胞表型穩(wěn)定等目前尚未明確。同種異體軟骨細胞具有來源廣泛，可以一次性獲取大量細胞等優(yōu)點，在三維立體培養(yǎng)環(huán)境下可保持軟骨細胞分化特性，根據(jù)以往實驗

4、證實異體軟骨細胞移植不發(fā)生嚴重免疫排斥反應，顯示同種異體軟骨細胞可以作為軟骨組織工程的種子細胞。 理想的支架對于成功構(gòu)建組織工程軟骨也至關(guān)重要。天然材料具有良好的細胞和組織相容性，但因初始機械力學強度不足現(xiàn)已較少使用，人工材料具有易加工、降解速率可調(diào)節(jié)、力學性能好、來源穩(wěn)定等優(yōu)點，但是一般人工合成的可降解材料具有較強疏水性的表面，而且其表面缺乏細胞可以識別的位點，因而普遍不具有良好的細胞相容性。將天然材料與人工材料以一定的方式結(jié)

5、合起來，制成合成的多孔支架，以使兩者的優(yōu)點相結(jié)合，可望制得較理想的軟骨組織工程支架。 為成功構(gòu)建工程軟骨，需要促進軟骨細胞的增殖、維持細胞的表型、增進胞外基質(zhì)的合成，已證實有多種細胞因子如TGF-β、bFGF、IGF、HGF等能促進軟骨形成或刺激細胞增殖。近年來BMP7被發(fā)現(xiàn)能維持軟骨細胞的表型，誘導軟骨細胞外基質(zhì)如蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成，并抑制由白介素-1(interleukin-1，IL-1)介導的軟骨基質(zhì)分解代謝。BMP

6、7還能使體外培養(yǎng)中已經(jīng)表現(xiàn)反分化的軟骨細胞恢復表型，重新表達軟骨細胞特異性物質(zhì)。但外源性BMP7來源有限、半衰期短，易被創(chuàng)傷局部的蛋白酶所水解，且治療劑量相對較大，有可能導致毒性作用的產(chǎn)生限制了其應用。采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將BMP7因子的cDNA轉(zhuǎn)染軟骨細胞，可使之在體內(nèi)一定時間內(nèi)持續(xù)表達內(nèi)源性BMP7，以維持軟骨細胞的成軟骨生物學性狀。 本實驗研究擬選用幼兔的關(guān)節(jié)軟骨細胞為種子細胞，在體外不同培養(yǎng)條件下觀察軟骨細胞的生物學性狀變化；

7、通過構(gòu)建攜帶重組人BMP7cDNA的質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)擴增的軟骨細胞；同時采用Ⅰ型膠原和羥基磷灰石復合，構(gòu)建柱狀分層的支架；將軟骨細胞種植其中培養(yǎng)，構(gòu)建小型組織工程軟骨復合體，觀察植入動物體內(nèi)修復膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的轉(zhuǎn)歸。 二實驗方法與結(jié)果第一部分不同培養(yǎng)條件下軟骨細胞生物學性狀的變化方法：Ⅰ型膠原支架通過以下步驟制作：將EDC按比例加入Ⅰ型膠原溶液中混合，倒入制作好的模具內(nèi)，4℃靜置24h，-80℃冷凍1h后脫模，再在冷凍干

8、燥機中處理12h，得到Ⅰ型膠原支架。應用序列酶消化法自2周齡新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中分離軟骨細胞，單層培養(yǎng)擴增。通過細胞生長曲線的測定，流式細胞儀檢測細胞DNA周期，透射電鏡檢測，以及Ⅱ型膠原、S-100免疫組化染色檢測軟骨細胞在體外單層培養(yǎng)條件下的生物學性狀變化；將生長狀態(tài)良好的第2代細胞消化離心，接種于Ⅰ型膠原支架三維立體培養(yǎng)3周，經(jīng)相差倒置顯微鏡、掃描電鏡、組織學和免疫組織化學檢測軟骨細胞在膠原支架中三維立體培養(yǎng)條件下的生物學

9、性狀變化。 結(jié)果：體外單層培養(yǎng)的軟骨細胞呈三角或多角形，胞核大而圓，3代以前增殖速度快。隨著傳代次數(shù)的增加，增殖速度減慢，傳6代以后，細胞分裂能力明顯下降，細胞變形明顯，體積變大，表現(xiàn)出細胞老化和向成纖維細胞反分化的趨勢。第2代細胞Ⅱ型膠原、S-100免疫組化染色胞漿內(nèi)呈陽性反應，至第6代細胞Ⅱ型膠原、S-100免疫組化染色陰性。流式細胞儀檢測顯示第2代細胞處于S/G2M期細胞的比例比第6代細胞明顯高，說明傳代6代后細胞分裂增殖

10、明顯減慢。透射電鏡檢查第3代細胞核仁大，染色質(zhì)豐富，細胞內(nèi)可見大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體，第6代細胞出現(xiàn)空泡變性。軟骨細胞在Ⅰ型膠原支架表面呈長梭形，在支架內(nèi)部細胞聚集成團，呈圓形或卵圓形，細胞團中有基質(zhì)分泌，沉積于細胞周圍，部分區(qū)域形成類似于軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)，Ⅱ型膠原免疫組化染色示胞漿內(nèi)陽性反應。掃描電鏡觀察可見細胞成團地吸附于支架表面及孔隙側(cè)壁，并可見細胞間通過突起相互連接，或伸出偽足貼附于支架孔隙壁上。 第二部分重組人BMP7

11、質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染軟骨細胞后的表達方法：構(gòu)建重組人BMP7真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-rhBMP7，經(jīng)酶切和測序鑒定。在轉(zhuǎn)染試劑Effectene的介導下轉(zhuǎn)染軟骨細胞，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)液中加入G418篩選，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR和實時熒光定量PCR檢測BMP7基因轉(zhuǎn)染軟骨細胞后的瞬時表達，采用G418篩選和免疫組化染色檢測BMP7基因轉(zhuǎn)染軟骨細胞后的穩(wěn)定表達。MTT法和S-100免疫組化檢測BMP7基因轉(zhuǎn)染對軟骨細胞生物學性狀的影響。結(jié)果：構(gòu)建的真

12、核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-rhBMP7經(jīng)酶切PCR及DNA測序證實。pcDNA3.1-BMP7轉(zhuǎn)染軟骨細胞經(jīng)G418篩選，未得到轉(zhuǎn)染的細胞逐漸凋亡，轉(zhuǎn)染細胞長成細胞克隆，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測，擴增得到了相應的DNA片段，而未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞則明顯表達較弱，實時熒光定量PCR檢測BMP7基因拷貝數(shù)在轉(zhuǎn)染后軟骨細胞和未轉(zhuǎn)染的軟骨細胞之間有顯著差異，證明rhBMP7基因轉(zhuǎn)染軟骨細胞后其BMP7表達水平有明顯變化。MTT法檢測證實rhBMP7基因轉(zhuǎn)

13、染軟骨細胞的表達產(chǎn)物對細胞的增殖有促進作用，S-100免疫組化檢測轉(zhuǎn)染細胞呈陽性反應，未轉(zhuǎn)染軟骨細胞為陰性。 第三部分Ⅰ型膠原/羥基磷灰石柱狀分層支架的構(gòu)建及與軟骨細胞的體外相容性觀察 方法：Ⅰ型膠原/HA分層支架按以下步驟制備：將Ⅰ型膠原溶液加入分散的HA溶液中攪拌混合，加入EDC。調(diào)配形成不同比例的膠原-HA復合物，逐層加入模具，4℃靜置24h，放入-80℃過夜，再在冷凍干燥機中干燥12h后取出即可。選擇生長狀態(tài)良好

14、的第2、3代軟骨細胞消化離心，接種于Ⅰ型膠原/HA支架，經(jīng)相差倒置顯微鏡、掃描電鏡、組織學和免疫組織化學檢測軟骨細胞與支架的相容性。 結(jié)果：Ⅰ型膠原/HA為具有一定機械強度的柱狀分層的三維多孔支架，最上層為純膠原，底層為純HA，中間為膠原與HA復合。掃描電鏡觀察，支架表面為純膠原，具有不規(guī)則的通孔結(jié)構(gòu)，孔徑較均勻且相互連通，中間層為多孔的Ⅰ型膠原/HA復合。支架表面細胞數(shù)量較多，多數(shù)呈長梭形，支架內(nèi)部細胞聚集成團，呈圓形或卵圓形

15、，細胞團中有基質(zhì)分泌，沉積于細胞周圍，部分區(qū)域形成類似于軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)，靠近支架底部細胞很少。Ⅱ型膠原免疫組化染色示胞漿內(nèi)陽性反應。掃描電鏡觀察可見細胞成團地吸附于支架表面及孔隙側(cè)壁，并可見細胞間通過突起相互連接，或伸出偽足貼附于支架孔隙壁上。 第四部分轉(zhuǎn)基因組織工程軟骨移植修復兔膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損方法：體外分離培養(yǎng)2周齡新西蘭大白兔關(guān)節(jié)軟骨細胞，部分細胞進行重組人BMP7基因轉(zhuǎn)染，將兩種細胞分別種植于Ⅰ型膠原/HA支架構(gòu)建工程

16、軟骨復合體。在30只兔膝關(guān)節(jié)股骨髁或股骨滑車作一直徑3.5mm、深約3-4mm的軟骨缺損。分4組處理，即缺損曠置、單純支架植入、軟骨細胞+支架復合體植入、rhBMP7基因轉(zhuǎn)染軟骨細胞+支架復合體植入，分別于術(shù)后4、8、12、16周取材，進行大體觀察、組織學檢查和病理評分。 結(jié)論通過本實驗研究，得出以下結(jié)論：1.軟骨細胞在體外單層培養(yǎng)會發(fā)生去分化現(xiàn)象，失去細胞表型，高密度培養(yǎng)能減緩該過程，在Ⅰ型膠原支架中三維立體培養(yǎng)有利

17、于維持其細胞表型及功能。2.外源性重組人BMP7基因轉(zhuǎn)染軟骨細胞可以獲得高效表達，其表達產(chǎn)物具有一定的維持軟骨細胞表型及促進軟骨細胞增殖的作用，為軟骨組織工程的研究提供了改良的種子細胞。 3.具有柱狀分層結(jié)構(gòu)的Ⅰ型膠原/羥基磷灰石復合支架與軟骨細胞相容性良好，具有比膠原更強的力學性能，是比較理想的軟骨組織工程支架材料，但羥基磷灰石在體內(nèi)降解緩慢，誘導成骨以重建軟骨下骨的性能也不夠理想是主要缺陷。 4.同種異體軟骨細胞移植