Th17-IL-17及其單克隆抗體在大鼠小腸移植免疫調(diào)控中的作用研究.pdf

1、器官移植是臟器功能衰竭終末期的有效、常規(guī)性治療手段。隨著器官移植技術(shù)的不斷發(fā)展，許多器官的移植已經(jīng)成為現(xiàn)實(shí)。常用于移植的器官包括角膜、心臟、肺、胰腺、肝臟、小腸、腎臟、骨髓等。而在我國(guó)，異基因器官移植在所有移植病例中占了絕大多數(shù)。其在給家庭和個(gè)人帶來希望的同時(shí)也面臨著重大的問題，即移植后嚴(yán)重的急性和慢性排斥反應(yīng)，它是導(dǎo)致受體死亡的主要原因。
　　小腸移植是腸衰竭患者最為理想的臨床標(biāo)準(zhǔn)治療方法。雖然小腸移植的臨床嘗試與開展已有半個(gè)世

2、紀(jì)，但是其效果與肝臟、腎臟和心臟移植相比仍有很大差距。究其原因，主要是因?yàn)樾∧c富含淋巴組織和大量的組織相容性抗原，患者在小腸移植術(shù)后會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的宿主抗移植物反應(yīng)、移植物抗宿主反應(yīng)和嚴(yán)重的全身感染。因此，對(duì)小腸移植術(shù)后產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)機(jī)制的深入研究及相應(yīng)對(duì)策的實(shí)施將是改善小腸移植預(yù)后的關(guān)鍵。
　　目前小腸移植排斥反應(yīng)的機(jī)制尚不完全清楚。在小腸移植排斥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程中，多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子參與了其中。而T細(xì)胞的分化增殖所介導(dǎo)的C

3、TL和B細(xì)胞以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在小腸移植術(shù)后免疫排斥的發(fā)生中發(fā)揮了重要作用。此外，參與免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子在該過程中也發(fā)揮了極其重要的作用。IL-2和IFN-γ是Th1細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，具有廣泛的免疫調(diào)控和免疫增強(qiáng)作用，可促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化，以加重移植排斥反應(yīng)。TNF、IL-6、IL-8在加重排斥反應(yīng)過程中也具有類似的作用。而IL-4通過抑制IL-1、IL-6和TNF的分泌，抑制T、B細(xì)胞的活化而抑制移植排斥

4、反應(yīng)。TGF-β、IL-10和內(nèi)皮素ET則可以下調(diào)移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)。
　　Th17是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)CD4+T淋巴細(xì)胞的亞群，其不同于Th1、Th2細(xì)胞亞群，主要表達(dá)IL-17。IL-17是一種作用很強(qiáng)的促炎因子，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子如IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-8的表達(dá)，引起細(xì)胞浸潤(rùn)和組織破壞。其主要的靶細(xì)胞為上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等。研究表明，其在自身免疫性疾病、炎癥、腫瘤和移植免疫等疾病中發(fā)揮了重要作

5、用。IL-17通過與IL-17R結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，而這些靶細(xì)胞在小腸組織中含量尤為豐富。由IL-17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在小腸組織中更為嚴(yán)重。因此，我們?cè)O(shè)想其生物學(xué)功能可能與小腸移植排斥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。
　　FK506是一種新型高效的免疫抑制劑，較CsA有更強(qiáng)的免疫抑制作用，使小腸作為單一移植物已成為可能，在移植患者中得到了廣泛應(yīng)用。FK506通過抑制移植排斥相關(guān)細(xì)胞因子(IL-2等)的產(chǎn)生進(jìn)而抑制T細(xì)胞活化，以抑制移植

6、后免疫排斥反應(yīng)。此外，F(xiàn)K506還可以抑制排斥反應(yīng)早期淋巴細(xì)胞在移植部位的聚集以及其它炎癥細(xì)胞的趨化。FK506對(duì)免疫排斥的抑制作用是否也有Th17/IL-17的參與目前仍不清楚。FK506雖然在臨床小腸移植術(shù)后廣泛應(yīng)用，但因其使用劑量大，嚴(yán)重的腎毒性和神經(jīng)毒性等毒副作用仍不容忽視。因此，深入研究小腸移植免疫排斥的分子機(jī)理并開發(fā)新的抗排斥藥物勢(shì)在必行。
　　鑒于Th17/IL-17在免疫反應(yīng)中的重要作用，本課題采用大鼠同種異體小腸

7、移植模型和人小腸移植活檢標(biāo)本研究Th17/IL-17是否參與了小腸移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)，研究Th17/IL-17在FK506抗排斥反應(yīng)中可能的作用，探索性地觀察IL-17單克隆抗體在小腸移植術(shù)后免疫排斥中的保護(hù)作用，為小腸移植術(shù)后排斥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制的研究提供了依據(jù)，為IL-17單克隆抗體的臨床應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。主要結(jié)論如下：
　　1、證明了人活體小腸移植術(shù)后移植腸Th17/IL-17的表達(dá)與急性排斥反應(yīng)正相關(guān)。
　　為了

8、探索在人小腸移植術(shù)后移植腸Th17/IL-17與排斥反應(yīng)之間的關(guān)系，我們收集、整理了我科1999年-2003年間的4例活體血緣性小腸移植患者圍手術(shù)期移植腸活檢標(biāo)本及相關(guān)資料，用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)了移植腸浸潤(rùn)C(jī)D4+IL-17+Th17細(xì)胞的表達(dá)情況，證明了小腸移植患者術(shù)后移植腸Th17/IL-17的表達(dá)與急性排斥反應(yīng)的相關(guān)性。提示，Th17/IL-17表達(dá)水平的升高可能在患者小腸移植術(shù)后強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)過程中發(fā)揮了重要作用。IL-1

9、7可能成為小腸移植急性排斥反應(yīng)早期重要的預(yù)警指標(biāo)和特異、敏感的診斷指標(biāo)之一。
　　2、構(gòu)建了穩(wěn)定可靠的同種異體小腸移植動(dòng)物模型。
　　為了通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證上述假設(shè)，本課題采用一種自制、可調(diào)控的旋轉(zhuǎn)持續(xù)靜脈輸液裝置，與節(jié)段性異位小腸移植術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建了近交系大鼠F344→LEW的同種異體小腸移植模型。結(jié)果顯示，該輸液裝置能成功地為實(shí)驗(yàn)大鼠連續(xù)輸液1月以上，改善受體的血供和營(yíng)養(yǎng)，顯著提高移植成功率(95.0％)，為小腸移植

10、免疫的研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　3、小腸移植大鼠的移植腸內(nèi)Th17/IL-17表達(dá)也與急性排斥反應(yīng)正相關(guān)。
　　為了驗(yàn)證在大鼠小腸移植術(shù)后移植腸內(nèi)Th17/IL-17表達(dá)是否也與急性排斥反應(yīng)正相關(guān)。我們利用實(shí)時(shí)定量PCR、Westernblot、激光共聚焦顯微鏡和ELISA等方法檢測(cè)了移植腸及血清Th17/IL-17的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)了移植物中相關(guān)細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。結(jié)果顯示，IL-17mRNA在正常小腸組織中低表

11、達(dá)。在異基因移植未治療組大鼠急性排斥反應(yīng)期IL-17和RORγtmRNA表達(dá)持續(xù)升高。細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8和IFN-γmRNA在移植后第3，5，7天的表達(dá)也呈上升趨勢(shì)。相反，IL-4、TGF-β和Foxp3mRNA在異基因移植未治療組術(shù)后低表達(dá)，3，5，7天呈逐漸下降趨勢(shì)。
　　4、Th17/IL-17可能參與了FK506對(duì)移植排斥的抑制作用。
　　為了探討FK506對(duì)移植排斥的抑制作用是否有可

12、能通過Th17/IL-17發(fā)揮作用，在大鼠小腸移植術(shù)后給予FK506抗排斥治療，然后用上述方法檢測(cè)了相關(guān)細(xì)胞和因子的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K506治療能明顯降低IL-17的表達(dá)，減少移植腸內(nèi)Th17細(xì)胞的表達(dá)，抑制移植腸急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，移植物中TGF-βmRNA和Foxp3mRNA的表達(dá)升高。說明Th17/IL-17參與了FK506對(duì)移植排斥的抑制過程。
　　5、制備了IL-17單克隆抗體，應(yīng)用IL-17單克隆抗體治療可以在一定程

13、度上抑制小腸移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)，延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間。
　　為了探索IL-17單克隆抗體在抑制移植排斥中的作用，本研究利用雜交瘤克隆，制備抗大鼠IL-17mAb，并用于大鼠小腸移植術(shù)后的早期治療。我們發(fā)現(xiàn)，IL-17mAb治療組大鼠術(shù)后移植腸IL-17、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8mRNA表達(dá)降低，而IL-4和TGF-βmRNA表達(dá)緩慢升高。結(jié)果顯示，與異基因移植未治療組相比，IL-17mAb治療能明顯延長(zhǎng)大鼠存活

14、時(shí)間，術(shù)后移植腸組織病理學(xué)檢查無排斥反應(yīng)依據(jù)。說明，IL-17mAb治療可以有效抑制大鼠小腸移植術(shù)后的急性排斥反應(yīng)，明顯改善移植物的生存。
　　6、結(jié)論
　　通過本課題的研究，發(fā)現(xiàn)人小腸移植術(shù)后移植腸內(nèi)有Th17/IL-17的表達(dá)，且其表達(dá)程度與術(shù)后急性排斥反應(yīng)正相關(guān)。為了探索Th17/IL-17是否參與了小腸移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)，本研究通過構(gòu)建同種異體大鼠小腸移植模型，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，大鼠小腸移植術(shù)后移植腸內(nèi)也存在Th1

15、7/IL-17的表達(dá)，其表達(dá)與移植物免疫排斥程度呈正相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)移植腸RORγt、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8和IFN-γmRNA在移植后第3，5，7天的表達(dá)升高，而IL-4、TGF-β和Foxp3mRNA在異基因移植未治療組術(shù)后低表達(dá)，3，5，7天呈逐漸下降趨勢(shì)。
　　FK506治療能明顯降低IL-17的表達(dá)，抑制移植腸急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，升高移植物中TGF-βmRNA和Foxp3mRNA的表達(dá)。說明Th17/I

16、L-17參與了FK506對(duì)移植排斥反應(yīng)的抑制過程；移植術(shù)后早期應(yīng)用IL-17mAb可以抑制移植腸急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。
　　以上結(jié)果說明，Th17/IL-17參與了小腸移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，且許多細(xì)胞因子也參與其中，F(xiàn)K506可能通過下調(diào)小腸移植后移植腸內(nèi)和血清Th17/IL-17的表達(dá)而抑制急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。IL-17mAb的早期應(yīng)用證實(shí)了其在抑制移植排斥反應(yīng)中的有效性，為臨床小腸移植急性排斥反應(yīng)的防治和誘導(dǎo)免疫耐受提供了