胎盤(pán)生長(zhǎng)因子介導(dǎo)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障的體內(nèi)研究.pdf

1、目的：
　　 流行病學(xué)調(diào)查表明，大約有10％～30％的癌癥患者發(fā)生腫瘤腦轉(zhuǎn)移，我國(guó)每年的新增腦轉(zhuǎn)移瘤病例大約為1.7萬(wàn)。在各種腦轉(zhuǎn)移腫瘤中以肺癌腦轉(zhuǎn)移居多，約占全部病例的30％，其中小細(xì)胞型肺癌（smallcelllungcancer，SCLC）具有惡性度高，腦轉(zhuǎn)移發(fā)生時(shí)間早的特點(diǎn)。大約有50％的小細(xì)胞肺癌患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，其中有10％～20％的患者以腦部轉(zhuǎn)移瘤形成為疾病的首發(fā)癥狀，而80％的患者在確診后兩年發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，病人的致死

2、、致殘率高，預(yù)后差。因此，探討小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)于小細(xì)胞肺癌的防治具有重要的意義。
　　 腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜多步驟的病理過(guò)程，器官血管壁的通透性將影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。腦的血管系統(tǒng)具有特殊的血腦屏障（blood-brainbarrier，BBB）結(jié)構(gòu)，這個(gè)屏障在一定程度上可以阻止致病因子對(duì)腦的侵害，但是小細(xì)胞肺癌向器官轉(zhuǎn)移表現(xiàn)出對(duì)腦的“親嗜性”，這一病理特點(diǎn)提示小細(xì)胞肺癌可能具有影響血腦屏障通透性的腫瘤特性。近年的研究發(fā)

3、現(xiàn)了一些與小細(xì)胞肺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因（如PreproGRP和NMB-R），并且發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)移與肺癌細(xì)胞表面的酪氨酸激酶受體活性增高有關(guān)。本室研究發(fā)現(xiàn)，在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞穿過(guò)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（humanbrainmicrovascularendothelialcells，HBMEC）過(guò)程中激活了Rho/ROCK通路，使actin細(xì)胞骨架重排，破壞HBMEC間緊密連接（tightjunction，TJ）的完整性，從而促進(jìn)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞穿過(guò)血腦屏

4、障（FEBSletters，2006，580:4252-4260）。
　　 近年來(lái)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）與惡性腫瘤的關(guān)系受到重視，發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤組織VEGF表達(dá)上調(diào)，不僅能促進(jìn)腫瘤血管形成、促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，還能通過(guò)促進(jìn)血管的滲透性來(lái)加速腫瘤組織細(xì)胞進(jìn)出血管，因而加速了腫瘤的轉(zhuǎn)移。胎盤(pán)生長(zhǎng)因子（placentalgrowthfactor，PLGF）是血管內(nèi)皮細(xì)胞生

5、長(zhǎng)因子（VEGF）家族中的一員，多在病理?xiàng)l件下發(fā)揮生物學(xué)功能。在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，PLGF主要通過(guò)促進(jìn)腫瘤血管的新生而影響腫瘤的增殖。PLGF可以通過(guò)與VEGFR-1/Flt-1受體結(jié)合，協(xié)同VEGF發(fā)揮血管生成的作用。此外，還可以募集循環(huán)中的造血干細(xì)胞和單核細(xì)胞到腫瘤原發(fā)灶，促進(jìn)腫瘤血管的增殖。近來(lái)的研究表明，PLGF在腫瘤發(fā)生中具有雙重作用，一可以直接作用于腫瘤細(xì)胞而影響腫瘤細(xì)胞的遷移，二可以作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞影響其功能。本室進(jìn)一步研

6、究發(fā)現(xiàn)PLGF在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞穿過(guò)BBB過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，其與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGFR-1/Flt-1受體相結(jié)合，引發(fā)下游信號(hào)通路，激活Rho/ROCK通路，進(jìn)一步使細(xì)胞骨架系統(tǒng)重排、緊密連接破壞，從而使腫瘤細(xì)胞穿過(guò)血腦屏障。
　　 本研究主要是在前期研究的基礎(chǔ)上通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證PLGF是否在SCLC穿過(guò)血腦屏障過(guò)程中發(fā)揮了作用。
　　 方法：
　　 1、RT-qPCR檢測(cè)PLGF在不同肺癌細(xì)胞中

7、的表達(dá)情況
　　 2、利用體外血腦屏障模型，比較六種肺癌細(xì)胞穿過(guò)HBMEC單層的情況
　　 3、利用RNAi技術(shù)，構(gòu)建以腺病毒為載體的siPLGF表達(dá)系統(tǒng)，獲得病毒顆粒
　　 （1）含目的基因（siPLGF）穿梭子（shuttle）的構(gòu)建
　　 ①構(gòu)建雙鏈siPLGF：雙鏈短發(fā)夾oligoDNA退火連接
　　 ②線性化shuttle空載體與雙鏈siPLGF的連接
　　 ③重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、篩

8、選和鑒定
　　 （2）腺病毒的重組
　　 ①線性化載體shuttle（siPLGF）
　　 ②shuttle和pAdEasy腺病毒載體共轉(zhuǎn)化細(xì)菌BJ5183
　　 ③重組子的篩選和鑒定
　　 ④重組子（Ad-shuttle-siPLGF）的大量擴(kuò)增
　　 （3）病毒顆粒的包裝
　　 ①AD293細(xì)胞的培養(yǎng)
　　 ②初級(jí)病毒顆粒的形成
　　 ③二級(jí)病毒顆粒的形成

9、>　　 ④三級(jí)病毒顆粒的形成
　　 ⑤病毒顆粒滴度的測(cè)定
　　 4、Ad-si-PLGF感染3種SCLC，檢測(cè)其穿過(guò)HBMEC單層的情況
　　 （1）腺病毒感染3種SCLC
　　 （2）RT-qPCR鑒定PLGF-siRNA干擾效果
　　 （3）檢測(cè)感染后的SCLC穿過(guò)HBMEC單層的情況
　　 5、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　 （1）經(jīng)心室內(nèi)途徑接種肺癌細(xì)胞，分析不同肺癌細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的成瘤

10、特性
　　 ①接種前細(xì)胞的處理
　　 ②分別經(jīng)心室內(nèi)途徑接種6種肺癌細(xì)胞
　　 ③觀察腦內(nèi)和肺部的成瘤情況
　　 （2）頸內(nèi)動(dòng)脈接種腺病毒感染的SCLC
　　 ①腺病毒感染3種SCLC
　　 ②分別經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈途徑接種感染SCLC
　　 ③觀察腦內(nèi)和肺部的成瘤情況
　　 結(jié)果：
　　 1、PLGF在不同肺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況
　　 RT-qPCR檢測(cè)不同肺癌細(xì)胞

11、中PLGF的表達(dá)，NCI-H250（來(lái)源于小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移灶）和NCI-H209（來(lái)源于小細(xì)胞肺癌骨髓轉(zhuǎn)移灶）兩株小細(xì)胞肺癌細(xì)胞PLGF高表達(dá)；而NCI-H446（來(lái)源于小細(xì)胞肺癌胸水滲漏的細(xì)胞）則PLGF表達(dá)較低。而A549、NCI-H460和NCI-H292低表達(dá)PLGF。結(jié)果表明：PLGF可能與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，而且與腦轉(zhuǎn)移相關(guān)性大。
　　 2、利用體外血腦屏障模型，比較六種肺癌細(xì)胞穿過(guò)HBMEC單層的情況
　　 利用

12、體外血腦屏障模型，檢測(cè)CFSE熒光染色的六種肺癌細(xì)胞穿過(guò)HBMEC單層的情況，三種小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（NCI-H250、NCI-H209、NCI-H446）穿過(guò)數(shù)明顯高于非小細(xì)胞肺癌（A549、NCI-H460、NCI-H292）。
　　 3、構(gòu)建以腺病毒為載體的siPLGF表達(dá)系統(tǒng)，獲得病毒顆粒
　　 （1）成功構(gòu)建了攜帶短發(fā)夾siPLGF的穿梭載體：shuttle（siPLGF），并與腺病毒骨架載體成功重組，獲得腺病毒R

13、NAi重組子（Ad-shuttle-siPLGF）。
　　 （2）完成AD293細(xì)胞三次病毒包裝并獲得了病毒顆粒，含量為1.5×1011viruses。
　　 4、Ad-si-PLGF感染3種小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，檢測(cè)其穿過(guò)HBMEC單層的情況
　　 （1）腺病毒感染NCI-H250、NCI-H209、NCI-446三種細(xì)胞。
　　 （2）RT-qPCR檢測(cè)腺病毒感染的3種小細(xì)胞肺癌細(xì)胞PLGF，Ad-si-P

14、LGF組的PLGF表達(dá)明顯少于兩個(gè)對(duì)照組。
　　 （3）與感染Ad-shuttle-vector和Ad-shuttle-scramble的細(xì)胞相比，PLGF沉默的SCLC穿過(guò)HBMEC單層的細(xì)胞數(shù)明顯減少。
　　 5、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　 （1）經(jīng)心室內(nèi)接種6種肺癌細(xì)胞，在動(dòng)物體內(nèi)成瘤性有明顯差異
　　 NCI-H446和NCI-H460細(xì)胞成瘤性最好，NCI-H292和A549細(xì)胞成瘤性較好，而NCI-H20

15、9和NCI-H250細(xì)胞則成瘤性較差。六種肺癌細(xì)胞在肺部均可見(jiàn)成瘤，但未發(fā)現(xiàn)一例腦內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤。
　　 （2）頸內(nèi)動(dòng)脈接種腺病毒感染的SCLC成瘤情況
　　 三種小細(xì)胞肺癌細(xì)胞具有不同的腦轉(zhuǎn)移能力，NCI-H209的腦內(nèi)成瘤機(jī)會(huì)更高些，小細(xì)胞肺癌細(xì)胞腦轉(zhuǎn)移瘤主要發(fā)生在脈絡(luò)叢及腦皮質(zhì)層等血運(yùn)豐富部位。與對(duì)照組相比，PLGF沉默的SCLC無(wú)一例發(fā)生肺癌腦轉(zhuǎn)移，PLGF可能參與了SCLC穿過(guò)血腦屏障轉(zhuǎn)移入腦這一過(guò)程。