GLP-1通過激活A(yù)kt通路拮抗FFA誘導(dǎo)的PANDER表達(dá)及胰島β細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的：胰島β細(xì)胞凋亡是1型和2型糖尿病共同的發(fā)病基礎(chǔ)，脂毒性被證實(shí)是引起胰島β細(xì)胞凋亡的重要原因之一，其機(jī)制涉及復(fù)雜的信號通路和途徑，炎癥因子、細(xì)胞因子在其中有重要作用。GLP-1是近年發(fā)現(xiàn)的具有廣泛生物作用的多肽，它能拮抗多種因素誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡，有效保護(hù)胰島細(xì)胞，Akt/PKB這一影響胰島細(xì)胞生長與存活的關(guān)鍵激酶及其信號通路是目前較明確的GLP-1作用靶點(diǎn)之一。胰腺衍生因子(pancreatic derived factor,P

2、ANDER)是新近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性致凋亡細(xì)胞因子，主要在胰島細(xì)胞高度表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖、促胰島素釋放的刺激物、炎癥因子都可以上調(diào)其表達(dá)并引起胰島細(xì)胞凋亡。本課題的前期階段發(fā)現(xiàn)游離脂肪酸能刺激胰島βTC3細(xì)胞PANDER mRNA的表達(dá)，而GLP-1能明顯拮抗胰島細(xì)胞脂性凋亡，并同時(shí)顯著下調(diào)游離脂肪酸引起的PANDER mRNA的表達(dá)，提示PANDER可能是胰島β細(xì)胞脂性凋亡中的重要介質(zhì)，并與GLP-1的抗凋亡作用有關(guān)。本課題在以往研

3、究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步論證PANDER與胰島β細(xì)胞脂性凋亡的關(guān)系以及PANDER在GLP-1拮抗胰島β細(xì)胞脂性凋亡中的作用，并觀察其與Akt信號通道的關(guān)系，以明確PANDER與胰島β細(xì)胞脂性凋亡及GLP-1拮抗胰島β細(xì)胞脂性凋亡是否相關(guān)及可能的機(jī)制。
　　 方法：(1)不同濃度PA(0.25mM,0.50mM,1.0mM)處理的βTC3細(xì)胞12小時(shí)，利用Hoechst33258核熒光染色熒光顯微鏡下觀察胰島β細(xì)胞凋亡形態(tài)及計(jì)算凋亡率

4、。(2)不同濃度PA(0.25mM,0.50mM,1.0mM)處理βTC3細(xì)胞12小時(shí)及0.5mM的PA處理6、12、24小時(shí)后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測PANDER mRNA表達(dá)。(3)βTC3細(xì)胞按空白對照組、PA組(0.5mmol/L PA)、PA+GLP-1組(0.5mmol/L PA+10nmol/L GLP-1)、GLP-1(10nmol/L GLP-1)分別處理12小時(shí)后，以Western Blot法檢測βTC3細(xì)胞P

5、ANDER、Akt、pro-caspase3蛋白表達(dá)水平。(4)βTC3細(xì)胞按空白對照組、PA組(0.5mmol/L PA)、PA+GLP-1組(0.5mmol/LPA+10nmol/L GLP-1)、GLP-1(10nmol/L GLP-1)、PA+Akti-1/2組(0.5mmol/LPA+5umol/L Akti-1/2)、PA+GLP-1+Akti-1/2組(0.5mmol/L PA+10mol/L GLP-1+5umol/L

6、Akti-1/2)、GLP-1+Akti-1/2組(10nmol/L GLP-1+5umol/L Akti-1/2)分別處理12小時(shí)后，以Western Blot法檢測βTC3細(xì)胞PANDER蛋白表達(dá)，Hoechst33258核染色法檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果：(1)PA能濃度依賴性地誘導(dǎo)βTC3細(xì)胞凋亡：Hoechst33258核染色法檢測對照組細(xì)胞凋亡率為(5.2±1.7)％，0.25mM、0.50mM及1.0mM的PA

7、處理組βTC3細(xì)胞凋亡率分別為(18.4±3.3)％(與對照組相比，P＜0.05)、(35.6±6.7)％(與對照組相比，P＜0.01)、(42.5±5.3)％(與對照組相比，P＜0.01)。(2)PA在誘導(dǎo)βTC3凋亡的同時(shí)濃度依賴性及時(shí)間依賴性地增加βTC3細(xì)胞PANDER mRNA的表達(dá)：不同濃度PA(0.25mM,0.50mM,1.0mM)處理βTC3細(xì)胞12小時(shí)，設(shè)定對照組PANDERmRNA表達(dá)量為1，0.25mM、0.50

8、mM、1.0mMPA處理組PANDER mRNA的表達(dá)量分別是對照組的(1.12±0.21)倍，(1.47±0.17)倍，(1.35±0.16)倍，與對照組相比，0.50mM及1.0mM處理組PANDER mRNA的表達(dá)均顯著增加(P＜0.01)；0.50mM的PA分別處理βTC3細(xì)胞0、6、12、24小時(shí)，PA處理6h、12h、24h后PANDER mRNA的表達(dá)量分別是對照組的(1.08±0.17)倍，(1.35±0.11)倍，(2

9、.88±0.45)倍，隨著PA處理時(shí)間的延長，PANDERmRNA的表達(dá)增加，其中0.50mM處理12小時(shí)組與對照組相比P＜0.05，0.50mM處理24小時(shí)組與對照組相比P＜0.01。(3)PA增加PANDER蛋白表達(dá)的同時(shí)，抑制Akt蛋白磷酸化，促進(jìn)caspase-3激活，GLP-1可以拮抗PA的上述效應(yīng)：以對照組PANDER蛋白的相對表達(dá)為100％，PA組PANDER蛋白相對表達(dá)為(148±18)％，較對照組明顯增加(P＜0.05

10、)，PA+GLP-1組PANDER蛋白相對表達(dá)為(70±17)％，較PA組明顯下降(P＜0.05)；以對照組p-Akt蛋白的相對表達(dá)為100％，PA組p-Akt蛋白相對表達(dá)為(63±30)％，PA+GLP-1組p-Akt蛋白相對表達(dá)為(99±19)％，PA組p-Akt蛋白表達(dá)較對照組明顯降低(P＜0.05)，而PA+GLP-1組p-Akt蛋白表達(dá)較PA組明顯升高(P＜0.05)，GLP-1組p-Akt蛋白相對表達(dá)為(137±27)％，較

11、對照組明顯升高(P＜0.05)；以對照組pro-capse3蛋白的相對表達(dá)為100％，PA組pro-caspase3蛋白相對表達(dá)為(54±5)％，PA+GLP-1組pro-caspase3蛋白相對表達(dá)為(89±23)％，PA組pro-caspase3蛋白表達(dá)較對照組明顯降低(P＜0.05)，即PA激活Caspase-3，而PA+GLP-1組pro-caspase3蛋白表達(dá)較PA組升高(P＜0.05)。GLP-1對未經(jīng)PA作用的細(xì)胞的PA

12、NDER及Caspase-3無影響，但明顯抑制在PA誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞中PANDER過表達(dá)和Caspase-3激活。(4)GLP-1拮抗PA致凋亡作用的同時(shí)抑制PA誘導(dǎo)的PANDER表達(dá)，Akt抑制劑減弱GLP-1的以上效應(yīng)：以對照組PANDER蛋白的相對表達(dá)為100％，PA組PANDER蛋白表達(dá)為(202±61)％，PA+Akti-1/2組PANDER蛋白相對表達(dá)為(246±60)％，與PA組無明顯差異，但細(xì)胞凋亡率較對照組及PA組升高(

13、P＜0.05)；PA+GLP-1+Akti-1/2組PANDER蛋白相對表達(dá)為(249±49)％，較PA+GLP-1組(110±54)％顯著升高(P＜0.01)，細(xì)胞凋亡率顯著高于PA+GLP-1組(P＜0.01)；GLP-1+Akti-1/2組PANDER蛋白相對表達(dá)為(257±86)％，較GLP-1組(131±47)％顯著升高(P＜0.01)，細(xì)胞凋亡率亦高于GLP-1組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：(1)PANDER與胰