ABCA1在LPC誘導(dǎo)膽固醇外流中的作用及其調(diào)控蛋白基因的初步篩選.pdf

1、巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)代謝紊亂在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的形成中起關(guān)鍵作用，血管內(nèi)膜下巨噬泡沫細(xì)胞募集是AS形成和發(fā)展中的早期病理變化。巨噬細(xì)胞通過(guò)低密度脂蛋白受體(lowdensitylipoproteinreceptor，LDL-R)途徑攝取血漿和間質(zhì)液中氧化型LDL(oxidizedLDL，oxLDL)，由于這條途徑不存在負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制，造成細(xì)胞內(nèi)大量脂質(zhì)蓄積，最終導(dǎo)致泡沫細(xì)胞的形成。因而阻斷巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫

2、細(xì)胞，是抗AS的主要的作用環(huán)節(jié)之一。 本研究的目的在于探討ABCA1作為膽固醇外流的關(guān)鍵作用因子，是否介導(dǎo)LPC誘導(dǎo)的巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇外流；在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究LXRα-ABCA1途徑是否在LPC誘導(dǎo)的巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇外流中發(fā)揮作用，以及LPC是否通過(guò)LXRα-ABCA1途徑誘導(dǎo)apoE作為ABCA1轉(zhuǎn)運(yùn)出的膽固醇接受體從而促進(jìn)膽固醇外流，同時(shí)為進(jìn)一步闡明ABCA1的調(diào)控機(jī)制，利用酵母單雜交初步篩選可與ABCA1啟動(dòng)子上DR

3、-4順式元件結(jié)合的特異性蛋白cDNA克隆，為將來(lái)開(kāi)發(fā)利用ABCA1作為AS治療的靶受體提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 研究方法： 1.巨噬泡沫細(xì)胞模型的建立及膽固醇外流檢測(cè)巨噬細(xì)胞取自NIH小鼠或apoE基因缺陷小鼠腹腔，進(jìn)行原代培養(yǎng)；健康人血漿經(jīng)超速離心分離制得LDL，用硫酸銅對(duì)LDL進(jìn)行氧化修飾，制備的oxLDL與細(xì)胞孵育48h，使細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘膳菽?xì)胞。采用油紅O染色法檢測(cè)泡沫細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)。 用酶學(xué)熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總膽固醇

4、含量及培養(yǎng)基的游離膽固醇含量，以細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量減少及培養(yǎng)基的游離膽固醇含量增加作為膽固醇外流增加的評(píng)價(jià)指標(biāo)；以細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量上升及培養(yǎng)基的游離膽固醇含量下降作為膽固醇外流減少或受抑制的評(píng)價(jià)指標(biāo)。 2.LPC誘導(dǎo)巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇外流LPC分為10、20、40、80μM4個(gè)組，分別與泡沫細(xì)胞共孵育24h；另外用ABCA1、LXRα的抑制劑先阻斷12h、24h后，再用40μMLPC誘導(dǎo)后，檢測(cè)膽固醇外流。 3.ABC

5、A1、LXRα基因表達(dá)的檢測(cè)用Real-timePCR檢測(cè)各基因的mRNA表達(dá)；用Westernblot測(cè)定各基因的蛋白表達(dá)水平。 4.誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建與報(bào)告酵母的制備設(shè)計(jì)并人工合成三串連的人ABCA1基因啟動(dòng)子上的DR-4片段，定向插入DNA-BD載體，通過(guò)DNA測(cè)序的方法鑒定正確重組子；將攜帶正確誘餌片段的重組子轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞株YM4271中，通過(guò)嚴(yán)格的3-AT抑制試驗(yàn)獲得酵母單雜交宿主細(xì)胞，為篩庫(kù)做準(zhǔn)備。 5.文庫(kù)篩選

6、篩選人肝臟的cDNA酵母雜交文庫(kù)，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)和3-AT加壓的方法，收獲啟動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)的初篩陽(yáng)性克??；抽提酵母初篩陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后獲得單一文庫(kù)質(zhì)粒，將純化的單一文庫(kù)質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)入酵母單雜交宿主細(xì)胞，在酵母體內(nèi)一對(duì)一驗(yàn)證激活報(bào)告基因的作用，獲得復(fù)篩陽(yáng)性克隆；復(fù)篩為陽(yáng)性的克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)入LacZ報(bào)告酵母，以colony-lift-filter-assay篩選LacZ陽(yáng)性克隆，得到雙陽(yáng)性克隆。 6.測(cè)序分析對(duì)雙陽(yáng)性克隆c

7、DNA測(cè)序，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行同源性分析。 主要研究結(jié)果： 1.LPC通過(guò)誘導(dǎo)ABCA1表達(dá)促進(jìn)巨噬泡沫細(xì)胞中的膽固醇外流體外培養(yǎng)的NIH小鼠腹腔巨噬泡沫細(xì)胞中加入不同濃度的LPC(10，20，40，80μM)培養(yǎng)，引起細(xì)胞膽固醇外流增加，上述各劑量的LPC均可以增加ABCA1mRNA和蛋白的表達(dá)(P＜0.01)，在10-80μM的劑量范圍內(nèi)呈劑量依賴(lài)關(guān)系。 在體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬泡沫細(xì)胞中加入40μMLPC培養(yǎng)不同

8、的時(shí)間(0，12，24h，48h)，隨著LPC與細(xì)胞作用時(shí)間的延長(zhǎng)，膽固醇外流增加(P＜0.01)，ABCA1mRNA和蛋白的表達(dá)亦顯著增加(P＜0.01)，在12-48h內(nèi)呈明顯的時(shí)間依賴(lài)關(guān)系。 小鼠泡沫細(xì)胞預(yù)先與400μM的DIDS(ABCA1抑制劑)作用12h、24h后，再與40μMLPC作用24h，DIDS預(yù)處理降低了ABCA1mRNA和蛋白的表達(dá)，LPC誘導(dǎo)的膽固醇外流受到顯著抑制(P＜0.01)。 2.LPC

9、通過(guò)上調(diào)LXRα的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)ABCA1介導(dǎo)膽固醇外流用不同濃度的LPC(10，20，40，80μM)與小鼠腹腔巨噬泡沫細(xì)胞共孵育，引起膽固醇外流增加，各劑量的LPC在增加ABCA1mRNA和蛋白表達(dá)的同時(shí)，LXRα的mRNA和蛋白的表達(dá)也增加(P＜0.01)，在10-80μM的劑量范圍內(nèi)呈劑量依賴(lài)關(guān)系。 40μMLPC與泡沫細(xì)胞作用不同的時(shí)間(0，12，24、48h)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，膽固醇外流增加(P＜0.01)，LXRα

10、mRNA和蛋白的表達(dá)同樣顯著增加(P＜0.01)，在12-48h內(nèi)呈時(shí)間依賴(lài)關(guān)系。 細(xì)胞經(jīng)10mMGGPP(LXRα的抑制劑)孵育12h、24h后，再與40μMLPC作用24h，結(jié)果表明GGPP不僅阻斷LXRα的表達(dá)，并導(dǎo)致ABCA1mRNA和蛋白的表達(dá)減少(P＜0.01)和顯著抑制LPC誘導(dǎo)的膽固醇外流(P＜0.01)。 3.LPC通過(guò)apoE介導(dǎo)LXRα-ABCA1途徑誘導(dǎo)膽固醇外流分別以40μMLPC和10μgap

11、oAI與正常C57BL/6J小鼠巨噬泡沫細(xì)胞作用不同時(shí)間，再以同樣的方式處理apoE基因缺陷小鼠(E0)的巨噬泡沫細(xì)胞。在24h和48h與正常組比較，ABCA1和LXRα的mRNA表達(dá)在LPC或apoAI組誘導(dǎo)的apoE基因缺陷小鼠巨噬泡沫細(xì)胞中均有所下降(p＜0.05)，但仍保持有較高的表達(dá)量(＞105copies/μgRNA)，由于apoE的缺失，LPC引起的細(xì)胞膽固醇外流顯著受阻(p＜0.01)，而apoAI引起的膽固醇外流則未受

12、到影響(p＞0.05)。LPC通過(guò)LXRα-ABCA1途徑誘導(dǎo)膽固醇外流必須有apoE的參與。 4.誘餌質(zhì)粒與報(bào)告酵母的構(gòu)建成功獲得了攜帶DR-4三串子誘餌片段的重組子；將攜帶正確誘餌片段的重組子轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞株YM4271中，在60mM的3-AT壓力下獲得了基因組上整合有誘餌片段的酵母單雜交宿主細(xì)胞。 5.文庫(kù)的篩選在人肝臟cDNA文庫(kù)中，初篩獲得了陽(yáng)性候選克隆48個(gè)；復(fù)篩獲得陽(yáng)性候選克隆32個(gè)，藍(lán)斑選擇后獲得4個(gè)雙陽(yáng)性

13、cDNA克隆。 6.測(cè)序結(jié)果對(duì)DNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了初步的生物信息學(xué)分析，Blast結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個(gè)序列片斷分別與絲氨酸蛋白酶抑制物、金屬硫蛋白、結(jié)合珠蛋白α1S、細(xì)胞色素P450的部分mRNA高度同源。 結(jié)論： 1.LPC誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流，該誘導(dǎo)作用可被ABCA1的阻斷劑DIDS抑制，表明ABCA1參與了LPC誘導(dǎo)的巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇外流過(guò)程。 2.LPC增加ABCA1和LXRα的表達(dá)，LXRα的阻斷劑G

14、GPP降低LXRα和ABCA1的表達(dá)，提示LXRα可以調(diào)控ABCA1的表達(dá)，LPC通過(guò)LXRα-ABCA1途徑誘導(dǎo)細(xì)胞膽固醇外流。 3.LPC可能通過(guò)apoE介導(dǎo)的LXRα-ABCA1途徑促進(jìn)膽固醇外流，可能的機(jī)制是：LPC通過(guò)上調(diào)LXRα、ABCA1誘導(dǎo)刺激apoE的分泌，apoE可作為膽固醇的接受體，接受ABCA1從細(xì)胞中移出的膽固醇。 4.通過(guò)酵母單雜交技術(shù)，篩選出4個(gè)可與ABCA1啟動(dòng)子上DR-4順式元件結(jié)合的特