產(chǎn)氫—產(chǎn)乙醇細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、有機(jī)廢水發(fā)酵法生物制氫技術(shù)具有能源和環(huán)保的雙重功效，已經(jīng)成為環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。雖然，發(fā)酵法生物制氫技術(shù)有著廣闊的應(yīng)用前景，但是該技術(shù)還處于研發(fā)階段。提高系統(tǒng)的產(chǎn)氫效率和運(yùn)行穩(wěn)定性，降低生產(chǎn)成本，仍然是生物制氫技術(shù)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化進(jìn)程中面臨的根本問題。
　　利用活性污泥作為菌種發(fā)酵產(chǎn)氫時(shí)，反應(yīng)系統(tǒng)中的微生物群落結(jié)構(gòu)對產(chǎn)氫效能具有決定性的影響。因此，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段闡明微生物群落結(jié)構(gòu)與產(chǎn)氫效能的關(guān)系，確定重要的功能菌群，

2、建立產(chǎn)氫群落的快速分子檢測系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)高效產(chǎn)氫群落的定向構(gòu)建和優(yōu)化，對實(shí)現(xiàn)發(fā)酵法生物制氫技術(shù)的工業(yè)化具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。目前，這些內(nèi)容還沒有被系統(tǒng)性地研究。目前所報(bào)道的產(chǎn)氫細(xì)菌都因不具備凝集能力，而造成大量流失，降低了系統(tǒng)的產(chǎn)氫效能。而通過載體固定化技術(shù)必然大幅度增加運(yùn)行成本。所以，分離具有高效產(chǎn)氫并能形成顆粒生長的自凝集細(xì)菌，通過生物強(qiáng)化作用實(shí)現(xiàn)高效產(chǎn)氫群落結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，對實(shí)現(xiàn)發(fā)酵法生物制氫工業(yè)化更具有現(xiàn)實(shí)意義和重要的應(yīng)用價(jià)值。

3、
　　針對目前發(fā)酵法生物制氫技術(shù)工業(yè)化進(jìn)程中存在的問題，進(jìn)行了自凝集產(chǎn)氫細(xì)菌的分離和篩選，并結(jié)合DGGE、FISH、克隆文庫、Real-time PCR、酶電泳等分子生物學(xué)手段，重點(diǎn)探討了微生物群落結(jié)構(gòu)和產(chǎn)氫效能的關(guān)系，深入研究了乙醇型產(chǎn)氫發(fā)酵的形成機(jī)制，開發(fā)了產(chǎn)氫細(xì)菌的快速檢測方法，初步探討了生物強(qiáng)化技術(shù)定向優(yōu)化群落結(jié)構(gòu)。論文取得了一些創(chuàng)新性的研究成果。
　?。?）發(fā)現(xiàn)并建立了產(chǎn)乙醇桿菌屬（Ethanoligenens）。

4、根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、獨(dú)特的化能異養(yǎng)特性、G+C（mol％）含量和生理生化特征，證實(shí)所分離的菌株 YUAN-3T和菌株 X-29代表了與最相近的柔嫩梭菌（Clostridium leptum）亞群現(xiàn)有屬完全不同的一個(gè)新屬。分類名為Ethanoligenens harbinense gen. nov., sp. nov.，哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌（Ethanoligenens harbinense）為模式種，菌株YUAN-3T（=JCM12961T=

5、CGMCC1.5033T）為模式菌株。菌株YUAN-3T振蕩培養(yǎng)時(shí)可形成凝集顆粒，直徑一般為0.5～5mm，最大時(shí)可達(dá)到1.5cm，培養(yǎng)液澄清；最大比產(chǎn)氫率為2.81molH2/mol-glucose，最大產(chǎn)氫速率為27.6mmolH2/g-drycell·h；是目前唯一報(bào)道的自凝集產(chǎn)氫細(xì)菌。
　?。?）揭示了不同產(chǎn)氫發(fā)酵類型微生物群落結(jié)構(gòu)和演替規(guī)律。DGGE分析結(jié)果表明，反應(yīng)器在運(yùn)行7～14d時(shí)群落結(jié)構(gòu)變化最大，群落結(jié)構(gòu)的相似性

6、隨著運(yùn)行時(shí)間的增加而逐漸升高。微生物群落結(jié)構(gòu)的差異是導(dǎo)致產(chǎn)氫速率和發(fā)酵類型不同的直接原因。丙酸型、混合酸型和乙醇型群落結(jié)構(gòu)主要是由Low G+C Gram-positive bacteria，Bacteroides，Actinobacteria，γ-Proteobacteria菌群構(gòu)成，但是不同發(fā)酵類型優(yōu)勢種群的數(shù)量組成卻存在著很大的差異。乙醇型發(fā)酵產(chǎn)氫能力最高，為適宜的產(chǎn)氫發(fā)酵類型。
　?。?）揭示了乙醇型產(chǎn)氫發(fā)酵形成的生物機(jī)制

7、，證實(shí)了產(chǎn)氫-產(chǎn)乙醇細(xì)菌是乙醇型產(chǎn)氫發(fā)酵形成的直接原因。設(shè)計(jì)了發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌的Fe氫化酶基因（hydA）通用引物，證實(shí)能很好檢測群落中培養(yǎng)和未培養(yǎng)的產(chǎn)氫細(xì)菌。hydA與16S rRNA的DGGE分析和cDNA克隆文庫均表明反應(yīng)器中的產(chǎn)氫細(xì)菌均是未培養(yǎng)的，與E. harbinense，Clostridium thermocellum，Syntrophobacter wolfei，Megasphaera elsdenii和Syntrophom

8、onas fumaroxidans親緣關(guān)系較相近，其中優(yōu)勢產(chǎn)氫細(xì)菌為E. harbinense和C. thermocellum相近的細(xì)菌。證實(shí)了利用乙醇脫氫酶（ADH）電泳技術(shù)可以分析群落中的未培養(yǎng)的產(chǎn)乙醇細(xì)菌。ADH酶譜顯示乙醇型產(chǎn)氫發(fā)酵的優(yōu)勢產(chǎn)乙醇細(xì)菌有三類，其中 ADH-I為非產(chǎn)氫種群， ADH-II和ADH-III分別為產(chǎn)氫細(xì)菌 E. harbinense和C. thermocellum相關(guān)的種群。據(jù)此，發(fā)現(xiàn)乙醇型產(chǎn)氫發(fā)酵群落中

9、的產(chǎn)氫-產(chǎn)乙醇細(xì)菌主要是E. harbinense及與E. harbinense和C. thermocellum親緣關(guān)系較近的未培養(yǎng)細(xì)菌。利用不同接種物，可以重現(xiàn)乙醇型發(fā)酵。
　　（4）利用自凝集產(chǎn)氫-產(chǎn)乙醇細(xì)菌實(shí)現(xiàn)了乙醇型產(chǎn)氫發(fā)酵的生物強(qiáng)化。分離了產(chǎn)乙醇桿菌的hydA基因，基于16S rRNA和hydA基因設(shè)計(jì)了產(chǎn)乙醇桿菌屬特異引物和探針，開發(fā)了其細(xì)胞數(shù)量和活性的特異檢測方法。實(shí)現(xiàn)了非滅菌條件下菌株 YUAN-3T的連續(xù)流產(chǎn)氫，