改性后的rhBMP-2聚乳酸緩釋納米微球的制備及促進(jìn)下頜骨缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、先天性畸形、腫瘤、以及外傷等因素造成的頜骨缺損修復(fù)一直是困擾口腔頜面外科醫(yī)生的一個(gè)難題。頜骨缺損一方面造成患者咀嚼、發(fā)音等功能障礙,另一方面造成美觀問題,加重患者的心理負(fù)擔(dān)。隨著社會(huì)的發(fā)展和進(jìn)步,交通事故的發(fā)生機(jī)率也越來越大,頜骨缺損的發(fā)生率日益增高。因此,探索更好的骨缺損修復(fù)方法是臨床研究的熱點(diǎn)之一。頜骨的缺損修復(fù)與全身其他部位骨缺損修復(fù)相比具有獨(dú)特性:固定和復(fù)位的要求更加嚴(yán)格;在復(fù)位固定后,進(jìn)食的限制也往往影響到骨缺損的愈合;必須在

2、恢復(fù)咀嚼、發(fā)音等功能的基礎(chǔ)上,同樣滿足患者對(duì)整體外觀的要求。因此,臨床上頜骨缺損修復(fù)必須要求嚴(yán)格的復(fù)位和固定,并力求骨缺損盡可能快的進(jìn)行修復(fù)。
　　組織工程化骨構(gòu)建是未來解決有成骨活性的頜骨缺損修復(fù)的方向。已有研究在缺損區(qū)內(nèi)植入含有誘導(dǎo)成骨能力的人重組骨形成蛋白-2(recombinantHumanbonemorphogeneticprotein-2,rhBMP-2)的可降解支架,沒有很好解決rhBMP-2體內(nèi)半衰期短,穩(wěn)定性差,

3、生物利用度低等缺點(diǎn)和支架材料親和性和降解性問題。rhBMP-2為早期骨缺損修復(fù)啟動(dòng)因子,可促進(jìn)軟骨和骨形成,其表達(dá)方式為誘導(dǎo)和促進(jìn)通過細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá),從而誘導(dǎo)細(xì)胞分化。
　　納米技術(shù)是一門在納米級(jí)下對(duì)物質(zhì)進(jìn)行制備,并與多個(gè)學(xué)科相互交叉發(fā)展的綜合性科技體系和交叉學(xué)科。納米微球被器官或者組織吸收,可以延長(zhǎng)藥效,提高利用度,可通過對(duì)包裹材料的調(diào)控從而實(shí)現(xiàn)體內(nèi)的納米微球緩釋并靶向分布。
　　基于以上分析,結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展,

4、本課題采用改性后聚乳酸(polylacticacid,PLA)為包裹材料,制備rhBMP-2-mPEG-PLA納米微球(rhBMP-2-mPEG-PLA-Ns)及mPEG-PLA-Ns納米微球,探討rhBMP-2緩釋系統(tǒng)加速頜骨缺損修復(fù)的方法。
　　rhBMP-2-mPEG-PLA納米微球及mPEG-PLA-Ns膠體液分別制成凝膠,研究微球藥物形態(tài)和粒徑分布;載藥量和包封率;體外緩釋時(shí)間等。建立兔下頜骨缺損模型,分別通過HE染色,

5、免疫組化檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA),觀察不同周期下rhBMP-2-mPEG-PLA納米微球和mPEG-PLA-Ns凝膠對(duì)頜骨缺損修復(fù)的療效。
　　實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果
　　1、mPEG-PLA-Ns和rhBMP-2-mPEG-PLA納米微球的制備和其物理、化學(xué)特性:
　　mPEG-PLA納米微球制備:Malvern激光粒度分布測(cè)試儀測(cè)定三組mPEG-PLA膠

6、體平均粒徑分別為160nm,158nm,169nm,達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。對(duì)rhBMP-2進(jìn)行精密度、二氯甲烷和丙酮混合物中穩(wěn)定性測(cè)定,證實(shí)rhBMP-2精密度和穩(wěn)定性可靠。采用復(fù)乳-干燥法(w/o/w)將rhBMP-2和mPEG-PLA制備成mPEG-PLA-Ns和rhBMP-2mPEG-PLA納米微球,通過透視電鏡和Malvern激光粒度分布測(cè)試儀測(cè)定,顯示微球的粒徑為45~50nm,該納米微球表面光滑圓整,球體大小均勻,粒徑分布范圍窄。通

7、過處方優(yōu)化采用1％乳糖作為支架劑,載藥量和包封率研究顯示rhBMP-2-mPEG-PLA納米微球包封率和載藥量分別為(78.2±1.81)%和[(2.24±0.24)×10-5]%,模擬體內(nèi)環(huán)境研究表明,rhBMP-2-mPEG-PLA納米微球在14d內(nèi),所釋放出的rhBMP-2的濃度能夠保持在一定的水平,并且能夠持續(xù)釋放rhBMP-2。rhBMP-2-mPEG-PLA納米微球濃度平均為(74.53±5.16)ng/ml。以累積釋放率和

8、時(shí)間一起進(jìn)行擬合,根據(jù)Higuichi方程,rhBMP-2-mPEG-PLA納米微球的體外釋放藥物率,Q=26.7687t1/2-12.3283,r=0.9962。體外釋放試驗(yàn)中,沒有發(fā)現(xiàn)突釋現(xiàn)象,24小時(shí)釋放率為23.47%,微球在21天后釋放度達(dá)78.56%。
　　2、mPEG-PLA-Ns和rhBMP-2-mPEG-PLA納米微球促進(jìn)下頜骨缺損修復(fù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn):
　　建立兔下頜骨缺損模型,隨機(jī)分為3組,建立動(dòng)物模型:空白

9、組,單純性mPEG-PLA納米微球緩釋凝膠組(對(duì)照組),rhBMP-2-mPEG-PLA納米微球緩釋凝膠組(實(shí)驗(yàn)組),在缺損區(qū)分別植入單純性mPEG-PLA納米緩釋凝膠和改性后的rhBMP-2-mPEG-PLA納米微球緩釋凝膠,分別在術(shù)后1周,2周,4周處死動(dòng)物。
　　對(duì)骨缺損斷端病理切片行HE染色觀察。結(jié)果提示:與空白組和對(duì)照組相比,試驗(yàn)組術(shù)后1周有新生骨小梁形成;術(shù)后2周有較多編織骨形成,成熟度高;術(shù)后4周編織骨進(jìn)一步增多、成

10、熟、融合,可見大量新生血管和繼發(fā)性骨痂形成,骨痂比例明顯高于空白組和對(duì)照組。
　　骨缺損斷端影像學(xué)顯示第1、2周,空白組可見缺損區(qū)域明顯,對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組缺損區(qū)相對(duì)空白組愈合較好,經(jīng)過4周后,空白組骨缺損區(qū)陰影仍然較大,未見明顯新生骨形成;對(duì)照組骨缺損區(qū)陰影縮小,缺損區(qū)周圍有新骨形成;實(shí)驗(yàn)組骨缺損區(qū)修復(fù)良好,骨缺損區(qū)陰影已不明顯。
　　骨缺損斷端病理切片PCNA免疫組化研究結(jié)果證實(shí),與空白組相比,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在1、2周PCN