RhBMP-2殼聚糖納米微球及復(fù)合人工骨的制備和成骨活性研究.pdf

1、研究背景：
　　 隨著現(xiàn)代工業(yè)、交通的飛速發(fā)展,各種外傷引起的骨缺損日益增多,另外骨腫瘤、感染以及畸形等疾病的治療也需要植骨或骨替代物治療。目前,自體骨移植仍是臨床最常用的方法,但供體的有限性及供骨區(qū)的相關(guān)并發(fā)癥限制了其應(yīng)用,并且增加了患者的痛苦。而異體骨具有較大的抗原性,特別是大型骨缺損需要較多骨量修復(fù)時,常因劇烈的免疫排斥反應(yīng)導(dǎo)致植骨失敗,且異體骨來源有限,尚存在潛在的疾病傳播、醫(yī)學(xué)倫理等問題,臨床應(yīng)用因而受到了限制。為了克

2、服自體骨以及異體骨應(yīng)用的諸多缺點和不利條件,尋找和開發(fā)能夠替代自然骨的人工骨修復(fù)材料越來越成為日益迫切的要求。
　　 骨組織工程為當(dāng)今骨科研究的熱點。組織工程是應(yīng)用工程學(xué)和生命科學(xué)的原理和方法,將種子細(xì)胞、特定組織的細(xì)胞因子與生物載體支架材料復(fù)合后進(jìn)行培養(yǎng),形成新的功能組織,來恢復(fù)和替代損傷組織的功能。這一概念是在1987年由美國國家科學(xué)基金會(NationalScienee Foundation,NsF)首次提出。1995年,

3、Crane等在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步系統(tǒng)地提出骨組織工程的科學(xué)意義、研究方法、研究現(xiàn)狀和前景,引起了人們對骨組織工程研究領(lǐng)域的普遍關(guān)注。國際材料學(xué)會1996年秋季會議指出,骨組織工程應(yīng)用的戰(zhàn)略可分為兩種:(1)將支架材料與細(xì)胞因子在體外組裝后植入體內(nèi),誘導(dǎo)新骨形成；(2)將成骨細(xì)胞在體外種植于材料后植入體內(nèi)。
　　 骨生長因子的研究一直是骨組織工程領(lǐng)域最熱門的課題之一。外源性生長因子因其能顯著促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞的增殖和分化、延緩細(xì)胞衰老、實現(xiàn)

4、缺損組織修復(fù)再生,但體內(nèi)直接應(yīng)用生長因子,會很快被稀釋代謝或酶的作用而失活。近年來不斷有學(xué)者進(jìn)行負(fù)載活性生長因子緩釋載體的研究,從傳統(tǒng)載體到各種載藥微球載體,使生長因子的緩釋時間不斷延長,適用范圍越來越廣。隨著控釋給藥、靶向給藥等新技術(shù)的不斷發(fā)展,活性生長因子的緩釋的研究正受到越來越廣泛的重視和關(guān)注。將納米控釋系統(tǒng)應(yīng)用于活性生長因子的緩釋,為外源性生長因子的開發(fā)與利用開辟了新的研究空間,成為組織工程領(lǐng)域的一個重要研究方向。特別是近年來納

5、米級微球控釋技術(shù)的發(fā)展和人工可降解材料及其復(fù)合材料的不斷涌現(xiàn),為組織工程化人工骨的研發(fā)提供了前所未有的機遇和條件。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogeneric proteins,BMP)是目前研究最充分、成骨活性最肯定的骨生長因子,美國食品和藥物管理局(Food and Drug administration FDA)也于2002年7月批準(zhǔn)重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(rhBMP-2)應(yīng)用于脊柱融合。rhBMP-2等外源性生長因子穩(wěn)定

6、性不好、體內(nèi)半衰期短、生物膜透過性差,應(yīng)用微球系統(tǒng)控制釋放多肽是解決緩釋的方法之一。
　　 高分子藥物緩釋載體分為合成高分子(聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚丙烯酸酯等)和天然高分子(明膠、纖維素、殼聚糖等)。合成高分子載體常常生物相容性不好,有時還因有毒物殘留、降解等作用產(chǎn)生毒性雜質(zhì)等,例如在聚乳酸的一般生產(chǎn)方法中使用了有機錫催化劑等,會產(chǎn)生細(xì)胞毒性。而天然高分子沒有上述缺點,其中殼聚糖的研究最為備受關(guān)注,這是因為殼聚糖作為為甲殼素脫乙酰

7、基產(chǎn)物,是天然多糖中唯一的堿性多糖,在自然界廣泛存在,取材便利,生物相容性良好,可生物降解且降解產(chǎn)物無毒性,而且具有抗菌、止血、抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等作用。殼聚糖微球作為藥物載體較其他材料制作的微球具有較明顯的優(yōu)勢:(1)殼微糖微球表面有豐富的功能基團(tuán),可通過吸附或包裹兩種方式靈活運載不同特性藥物,這是其它微球載體所不能達(dá)到的功能；(2)殼微糖微球粘附性較好,在口、鼻、胃腸等粘膜給藥時,特別是投遞抗原和佐劑,具有其獨特的優(yōu)勢；(3)殼聚糖微球

8、表面有豐富的多糖鏈,能被某些特異性細(xì)胞(或組織)所識別,可靶向性投遞藥物至病灶部位貯存釋放；(4)殼聚糖分子能作用于細(xì)胞間F-肌動蛋白,打開細(xì)胞通道,有利于提高藥物在細(xì)胞間瞬間滲透的能力。因此,自20世紀(jì)90年代以來,殼聚糖微球載體在藥物新劑型中的研究,已成為該領(lǐng)域研究的熱點。殼聚糖微球在組織工程中,也可用于細(xì)菌培養(yǎng)與控釋生長因子等。Jong等用乳化法交聯(lián)制備TGF-β1殼聚糖微球,將其軟骨細(xì)胞一同置入多孔的膠原-殼聚糖骨架中,體外培養(yǎng)

9、3d后,其軟骨細(xì)胞與粘多糖的量明顯高于TGF-1的溶液組。說明TGF-1殼聚糖微球更有利于軟骨細(xì)胞的形成。綜上所述,殼聚糖作為理想的藥物賦形劑,其微球與納米粒作為各類藥物的緩控釋與靶向載體的研究,已在世界范圍廣泛展開。
　　 目前關(guān)于載骨生長因子殼聚糖微球的研究主要集中在載藥微球本身的性質(zhì)、釋放規(guī)律及其對體外培養(yǎng)效應(yīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)及分化上,微球大小大多為微米級,而關(guān)于納米級載骨生長因子的殼聚糖微球研究較少,且進(jìn)一步將載藥微球復(fù)合至人

10、工骨并研究其成骨活性的研究少之又少,故本課題具有一定的創(chuàng)新性及研究意義。
　　 研究目的：
　　 1、利用離子交聯(lián)法制備出粒徑為納米級的負(fù)載重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的殼聚糖微球,對載藥微球理化特性進(jìn)行研究,通過研究其載藥率、包封率及緩釋動力學(xué)等,分析其藥理特性。
　　 2、采用國家標(biāo)準(zhǔn)中的植入材料的生物安全性評估實驗--體外細(xì)胞毒性性實驗來評估重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖納米微球的生物安全性,為進(jìn)一步的成骨活性

11、研究奠定基礎(chǔ)。
　　 3、體外培養(yǎng)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,并將重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖納米微球加入培養(yǎng)體系,與加入相同劑量的單純重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2對比,分析載藥微球?qū)Υ笫蠊撬杌|(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)及分化作用,評估載藥微球在體外對效應(yīng)細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)活性。
　　 4、行大鼠大腿肌袋異位成骨實驗,重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖納米微球組與單純植入同劑量的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2對比,評估重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚

12、糖納米微球的體內(nèi)異位骨誘導(dǎo)活性。
　　 5、將重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖納米微球與珊瑚羥基磷灰石(Corallinehydroxyapatite,CHA)復(fù)合,制備新型復(fù)合重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖納米微球的CHA復(fù)合人工骨,植入大鼠脊柱融合模型中,研究其骨誘導(dǎo)效應(yīng)。
　　 研究方法：
　　 1、采用離子交聯(lián)法制備重組入骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的殼聚糖納米微球,行載藥微球的電鏡觀察、激光粒徑分析、降解性能、檢測

13、載藥率、包封率并描述其緩釋藥動學(xué)。
　　 2、體外復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞,按國家標(biāo)準(zhǔn)中植入材料的生物安全性評估實驗行重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的殼聚糖納米微球及空白微球的細(xì)胞毒實驗,設(shè)陰性及陽性對照組,評估其生物安全性。
　　 3、體外行SD大鼠的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng),加入重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖納米微球及同劑量的單純重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2,通過MTT檢測法及堿性磷酸酶活性分析,研究體外重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋

14、白-2殼聚糖納米微球?qū)撬杌|(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化作用。
　　 4、將重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖納米微球與同劑量的單純重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2凍干粉植入SD大鼠大腿肌袋中,4周后大體觀察、X線檢查、組織學(xué)檢查、堿性磷酸酶活性分析、鈣含量測定,與植入單純同劑量的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2對比并評估載藥微球的異位成骨活性。
　　 5、利用低溫負(fù)壓凍干法將載藥微球與CHA人工骨復(fù)合制備重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的殼聚糖納米微球C

15、HA人工骨,建立大鼠后外側(cè)橫突間脊柱融合模型,并將復(fù)合人工骨用于該模型。通過CT掃描、三維重建以及手法觸診等檢查融合率情況,對有融合的大鼠進(jìn)行取材并行病理切片檢查等研究復(fù)合人工骨在體內(nèi)的成骨活性。
　　 結(jié)果：
　　 1、離子交聯(lián)法成功制備出負(fù)載重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的納米級殼聚糖微球,微球的成球性良好、形態(tài)規(guī)整、分散均勻,平均粒徑為230nm,包封率為(66.867±4.575)％,載藥率為33.437±2.290μ

16、g/mg,45d時降解率為(57.567±2.759)％,釋放為雙相動力學(xué),初相為突釋相,后為緩釋相,可繼續(xù)釋放重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2達(dá)30d,第30d釋放率為(90.133±3.564)％。
　　 2、經(jīng)小鼠成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒實驗,空白殼聚糖納米微球及重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖納米微球組三種不同濃度浸提液反應(yīng)等級為0或1級,均為合格。陰性對照為0級,陽性對照為5級。
　　 3、成功在體外行SD大鼠的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞

17、的傳代培養(yǎng),MTT檢測法及堿性磷酸酶活性分析等提示重組入骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖納米微球可明顯促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化,且活性較單純重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2組為強,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4、植入SD大鼠大腿肌袋中4周后,重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖納米微球組及單純重組入骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2組均成功誘導(dǎo)出異位骨組織,但載藥微球組較單純植入同劑量的單純重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2異位成骨量多,堿性磷酸酶及鈣含量

18、差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而空白微球組及陰性對照組無明顯成骨。
　　 5、將復(fù)合重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖納米微球的羥基磷灰石人工骨植入SD大鼠右側(cè)橫突間融合模型,4周時復(fù)合rhBMP-2殼聚糖納米微球的CHA人工骨組及復(fù)合rhBMP-2的CHA人工骨組全部融合,均獲得了100％的融合率,但復(fù)合rhBMP-2殼聚糖納米微球的CHA人工骨組的ALP活性及鈣含量較復(fù)合rhBMP-2的CHA人工骨組高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P

19、<0.05),而羥基磷灰石人工骨組及陰性對照組未融合。
　　 結(jié)論：
　　 1、采用離子交聯(lián)法制備工藝制備的殼聚糖納米微球可作為單純重組入骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的良好載體,工藝簡便易行,載體外形及穩(wěn)定性好,載藥率及包封率較好,并具有良好的釋藥及降解等特性,這為重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖納米微球進(jìn)一步應(yīng)用于骨組織工程修復(fù)骨缺損提供了一種新方法和新思路。
　　 2、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖納米微球體外細(xì)胞毒性試

20、驗采用了醫(yī)用有機硅材料生物學(xué)評價的國家標(biāo)準(zhǔn),方法簡單,結(jié)果準(zhǔn)確,對植入材料的生物相容性有重要的參考意義。結(jié)果表明空白殼聚糖納米微球及重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖納米微球反應(yīng)分級均為0-1級,即為合格,故重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖納米微球可作為一種較安全的植入材料進(jìn)行進(jìn)一步的骨組織工程實驗。
　　 3、重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖納米微球與SD大鼠的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的體外共培養(yǎng)結(jié)果提示重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖納米微球可

21、明顯促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化,且誘導(dǎo)活性強于單純重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2組,故重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖納米微球在體外的對效應(yīng)細(xì)胞的成骨活性良好,可作為骨生長因子載體繼續(xù)進(jìn)行進(jìn)一步體內(nèi)成骨活性研究。
　　 4、SD大鼠的大腿肌袋植入實驗證實了重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖納米微球組及單純單純重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2組均可成功誘導(dǎo)出異位骨組織,但載藥微球組較單純植入同劑量的單純重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2異位成骨活性更強,空

22、白微球組及陰性對照組無明顯成骨,可見重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖納米微球的在大鼠體內(nèi)的緩釋效果良好,故同劑量的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2在載藥微球組可表現(xiàn)出更強大的異位骨誘導(dǎo)活性。
　　 5、SD大鼠脊柱融合實驗顯示出復(fù)合重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖納米微球的羥基磷灰石人工骨具有很好的融合效果,表明重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2殼聚糖納米微球與羥基磷灰石人工骨復(fù)合后可繼續(xù)發(fā)揮其緩釋效應(yīng),提高骨誘導(dǎo)活性,也為進(jìn)一步大動物研究及臨床應(yīng)用