局部轉染lvOX40Ig和lvCTLA4Ig對同種異體復合組織移植的免疫調節(jié)作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　探討重組lvOX40Ig和lvCTLA4Ig局部轉染同種異體復合組織移植阻斷共刺激途徑，觀測目的基因在同種異體復合組織移植后對機體的免疫調節(jié)作用，以及局部表達OX40Ig和CTLA4Ig發(fā)揮免疫調節(jié)機制的研究。
　　方法:
　　構建了重組慢病毒載體OX40Ig和CTLA4Ig，體外同種異體復合組織局部目的基因轉染，使移植物局部能夠分泌OX40Ig和CTLA4Ig融合蛋白。檢驗慢病毒載體目的基因在293細胞的

2、表達，驗證其構建是否成功。采用近交系大鼠下腹壁淺動脈皮瓣移植模型，檢驗lvOX40Ig和lvCTLA4Ig介導的目的基因局部表達對阻斷OX40/OX40L以及CD28/B7共刺激途徑、延長移植物存活時間的作用。實驗分為6組，組Ⅰ：未處理組；組Ⅱ：LvEGFP組；組Ⅲ：小劑量雷帕霉素治療組；組Ⅳ：LvOX40Ig聯(lián)合小劑量雷帕霉素組；組Ⅴ：LvCTLA4Ig聯(lián)合小劑量雷帕霉素組；組Ⅵ：LvOX40Ig+LvCTLA4Ig聯(lián)合小劑量雷帕霉素

3、治療組。比較各組移植物成活狀況。檢驗其在移植物以及全身中的表達，混合淋巴細胞反應檢驗其免疫調節(jié)活性。檢測移植后各組免疫細胞，細胞因子以及免疫相關趨化因子的變化。
　　結果：
　　體外轉染LvOX40Ig和LvCTLA4Ig后，單一雷帕霉素治療相比較空白對照組移植物存活時間差別有統(tǒng)計學意義，單一灌注LvOX40Ig或者LvCTLA4Ig聯(lián)合小劑量雷帕霉素治療與空載體病毒組比較能夠顯著延長移植物的存活時間，差別有統(tǒng)計學意義（P<

4、0.05）。組織病理學檢查術后7天，空載體病毒組與空白對照組符合Banff2007標準的Ⅲ級及以上免疫排斥反應，在各個單一基因聯(lián)合小劑量雷帕霉素組及綜合用藥組的組織切片中可以觀察到移植物存活狀態(tài)顯著提高，顯微鏡下無免疫排斥反應的表現。移植物術后28天觀察顯示，空白對照組，空載體病毒組以及雷帕霉素組同種異體皮瓣無一存活。剩余三組LvOX40Ig組，LvCTLA4Ig組以及綜合用藥組的皮瓣表現出中等程度淋巴細胞浸潤。Westernblot以

5、及PCR免疫熒光組織化學顯示移植物局部目的基因的高表達，但是內臟器官無目的基因表達，術后45天仍有目的基因的表達。流式細胞術檢測CD4，CD8細胞含量以及比值的變化，提示各組與綜合治療組比較CD4+T細胞含量減低，CD4/CD8比值下降，免疫熒光組織化學顯示移植物中FOXP3+T細胞含量顯著上升。ELISA檢測血中各細胞因子含量顯示綜合治療組IL-2，INF-γ水平下降，IL-4，IL-10水平明顯上升。免疫組織化學檢測趨化因CCR5的