RecQ家族解旋酶在乳腺癌干細(xì)胞表達(dá)的初步研究.pdf

1、目的：探討篩選腫瘤干細(xì)胞的方法，在mRNA及蛋白質(zhì)水平檢測(cè)RecQ家族解旋酶在乳腺癌及其腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)水平，并探討其意義。
　　方法：（1）采用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)方法，對(duì)乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-435進(jìn)行無(wú)血清篩選培養(yǎng)。(2)Hoechst33342染料染色后流式細(xì)胞儀側(cè)群分析鑒定乳腺癌干細(xì)胞。（3）軟瓊脂糖凝膠腫瘤克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)乳腺癌干細(xì)胞成瘤性。（4）分別提取MDA-MB-435及其腫瘤干細(xì)胞、正常人肝細(xì)胞L-02、人臍帶

2、血干細(xì)胞、正常人淋巴細(xì)胞的Total RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，real—time PCR)檢測(cè)RecQ家族解旋酶(RecQL、BLM、WRN、RecQ4、RecQ5)的mRNA量，在轉(zhuǎn)錄水平探討乳腺癌細(xì)胞及其干細(xì)胞的RecQ家族解旋酶 mRNA差異。(5)WesternBlot檢測(cè)MDA-MB-435及其腫瘤干細(xì)胞、L-02、人肝癌細(xì)胞HepG2、正常人白細(xì)胞中

3、BLM及RecQ4的表達(dá)情況，在翻譯水平探討乳腺癌細(xì)胞及其腫瘤干細(xì)胞RecQ家族解旋酶差異。
　　結(jié)果：（1）采用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)方法篩選和培養(yǎng)MDA-MB-435腫瘤干細(xì)胞成功。（2）Hoechst33342染料染色后流式細(xì)胞儀側(cè)群分析鑒定腫瘤干細(xì)胞占整個(gè)細(xì)胞比例90％以上。（3）軟瓊脂糖凝膠腫瘤克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞成瘤性驗(yàn)證腫瘤干細(xì)胞克隆性生長(zhǎng)和成瘤潛能比 MDA-MB-435細(xì)胞明顯增強(qiáng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。

4、（4)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(real-time quantitative PCR，real-time PCR)檢測(cè)RecQ家族解旋酶成員RecQL、BLM、WRN、RecQ4、RecQ5的mRNA在不同細(xì)胞中表達(dá)水平發(fā)現(xiàn):與 MDA-MB-435相比，RecQL,BLM,WRN在腫瘤干細(xì)胞表達(dá)較 MDA-MB-435明顯下降（P<0.05），相反，RecQ4，RecQ5在腫瘤干細(xì)胞表達(dá)較 MDA-MB-435明顯升高（P<0.05）。（

5、5） WesternBlot檢測(cè)MDA-MB-435細(xì)胞及其腫瘤干細(xì)胞、L-02、HepG2、正常人白細(xì)胞中 BLM解旋酶的表達(dá)，表達(dá)量從低到高依次為正常人白細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、MDA-MB-435細(xì)胞、L-02、HY-2；RecQ4解旋酶的表達(dá)，表達(dá)量從低到高依次為正常人白細(xì)胞、MDA-MB-435細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、L-02、HY-2。BLM在腫瘤干細(xì)胞表達(dá)較MDA-MB-435下降，RecQ4在腫瘤干細(xì)胞表達(dá)較MDA-MB-435升高