聯(lián)合應(yīng)用胰島素與艾迪苯醌對糖尿病大鼠血腦屏障通透性的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　糖尿病是以慢性高血糖及多器官系統(tǒng)并發(fā)癥為特征的疾病，治療的主要目的是降低血糖，減少或延緩癥狀及并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。糖尿病腦病是糖尿病常見的并發(fā)癥之一。在糖尿病腦病的發(fā)生發(fā)展過程中，血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的改變可能是糖尿病腦病早期的病理生理學(xué)改變之一。血腦屏障結(jié)構(gòu)的破壞、通透性的增加，神經(jīng)元在高血糖、以及高血糖引起的氧化應(yīng)激、炎癥因子等一系列因素刺激下，發(fā)生凋亡、變性、甚至壞死。有報(bào)道證明糖尿病是神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變以及癡呆發(fā)生

2、的危險(xiǎn)因素，降糖藥物的使用可以減緩?fù)诵行圆∽兊陌l(fā)生和發(fā)展，但對于胰島素等降糖藥物對糖尿病血腦屏障功能的作用尚無一致性報(bào)道。緊密連接蛋白是保持血腦屏障完整性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，在緊密連接相關(guān)蛋白家族中，occludin、claudin-5是兩個(gè)代表性分子，有報(bào)道腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、claudin-5的表達(dá)減少與血腦屏障通透性的增加相關(guān)。
　　糖尿病時(shí)的高血糖狀態(tài)，使細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧自由基的產(chǎn)生增加，誘

3、導(dǎo)多種炎性因子產(chǎn)生增加，增加了細(xì)胞毒性作用，使血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等損傷。維生素E、姜黃素作為抗氧化劑在實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠的治療中顯示出了對抗減少自由基產(chǎn)生起的DNA和蛋白質(zhì)損傷，從而保護(hù)糖尿病大鼠神經(jīng)元和上皮細(xì)胞功能的作用。艾迪苯醌是一種臨床上使用的抗氧化劑，目前尚無艾迪苯醌對糖尿病血腦屏障影響方面的報(bào)道。
　　本文旨在研究探討胰島素與艾迪苯醌單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對糖尿病大鼠血腦屏障的影響及其可能機(jī)制，為糖尿病的血管神經(jīng)病變的治療提供

4、新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、鏈脲菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型的復(fù)制及實(shí)驗(yàn)分組
　　成年雄性Wister大鼠，禁食不禁水12小時(shí)后給予一次性腹腔注射1.3％（溶于檸檬酸鹽緩沖液pH值4.2-4.5）鏈脲菌素(streptozotocin，STZ)60mg/kg體重，以給藥2周后血糖值不低于16.7mol/l的大鼠做為糖尿病大鼠。隨機(jī)分為糖尿病組、胰島素給藥組、艾迪苯醌給藥組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用組，并設(shè)空白給藥組

5、（等劑量生理鹽水腹腔注射）做為對照。
　　2、胰島素及艾迪苯醌給藥
　　給予鏈脲菌素2周后大鼠用藥各組給予治療用藥，胰島素給藥組給予胰島素8U/kg，日兩次腹腔注射;艾迪苯醌給藥組給予艾地本醌30mg/kg，日一次灌胃給藥;胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合給藥組給予胰島素與艾迪苯醌同時(shí)給藥。體重及飲水隨時(shí)監(jiān)測，血糖監(jiān)測采用尾尖取血法利用血糖儀進(jìn)行監(jiān)測。
　　3、伊文氏蘭滲透實(shí)驗(yàn)檢測血腦屏障通透性
　　伊文氏蘭(Evans b

6、lue,EB)滲透試驗(yàn)用來檢測鏈脲菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血腦屏障通透性的變化，空白組做對照。選擇STZ給藥前，STZ造模2周，STZ造模4周，STZ造模8周，STZ造模12周做為時(shí)間觀察點(diǎn)檢測糖尿病大鼠血腦屏障通透性變化;給予STZ造模2周后，給予胰島素及艾迪苯醌治療用藥，以治療2周、6周、10周為時(shí)間觀察點(diǎn)采用EB滲透試驗(yàn)檢測胰島素及艾迪苯醌對血腦屏障通透性影響。
　　4、Western blot實(shí)驗(yàn)
　　治療用藥10周提取

7、大腦皮質(zhì)血管，提取蛋白樣品應(yīng)用western blot實(shí)驗(yàn)檢測occludin，claudin-5蛋白表達(dá)。取大腦皮質(zhì)血管蛋白檢測糖基化終術(shù)產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end product，RAGE)蛋白表達(dá)，應(yīng)用試劑盒提取大腦皮質(zhì)血管核蛋白檢測腦皮質(zhì)NF-κB P65蛋白表達(dá)。
　　5、透射電鏡觀察
　　治療用藥10周取材，應(yīng)用電鏡檢測大鼠血腦屏障超微結(jié)構(gòu)變化。
　　6

8、、ELISA實(shí)驗(yàn)
　　治療用藥10周取材，提取大鼠腦皮質(zhì)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay, ELISA)檢測腦皮質(zhì)晚期糖基化終術(shù)產(chǎn)物(advancedglycation end products，AGEs)含量。
　　7、統(tǒng)計(jì)分析
　　SPSS11.0軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用means±SD.兩兩比較采用t檢驗(yàn)。多組比較采用單因素方差分析，多重比較P＜0.05

9、認(rèn)為有顯著性差異。
　　結(jié)果:
　　一、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用對糖尿病大鼠血腦屏障的影響
　　1、伊文氏蘭滲透試驗(yàn)檢測血腦屏障通透性顯示糖尿病大鼠血腦屏障通透性隨糖尿病病程進(jìn)展變化
　　STZ給藥2周和4周時(shí)，糖尿病組與對照組相比血腦屏障通透性有增高趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。STZ給藥8周和12周時(shí)，糖尿病組與對照組相比血腦屏障通透性顯著增高。
　　2、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用增加糖尿病大鼠體重
　　與

10、對照組相比，治療前，治療2周、6周、10周各時(shí)間點(diǎn)，糖尿病組與對照組相比體重顯著降低;與糖尿病組相比，在治療2周、6周、10周時(shí)間點(diǎn)，胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用組均顯著增加了大鼠的體重。
　　3、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用降低糖尿病大鼠飲水量
　　與對照組相比，在治療前，治療2周、6周、10周各時(shí)間點(diǎn)，糖尿病組與對照組相比飲水量顯著增加;與糖尿病組相比，在治療2周、6周、10周時(shí)間點(diǎn)，胰島素組、艾迪苯醌組、

11、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用組均顯著降低了大鼠的飲水量。
　　4、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用降低糖尿病大鼠血糖
　　與對照組相比，在治療前，治療2周、6周、10周各時(shí)間點(diǎn)，糖尿病組和艾迪苯醌組分別與對照組相比血糖均顯著增加;與糖尿病組相比，在治療2周、6周、10周時(shí)，胰島素組和胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用組的血糖值均顯著降低，艾迪苯醌組的血糖值未見明顯變化。
　　5、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用降低糖尿病大鼠血腦屏障通透性
　

12、　在治療前和治療2周，對照組、糖尿病組、胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用組各組間的EB含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化;在治療6周，與對照組相比，糖尿病組和艾迪苯醌組的EB含量分別顯著增高;與糖尿病組相比，胰島素組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用組顯著降低了EB含量;在治療10周，與對照組相比，糖尿病組、胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用組的EB含量均顯著增加;與糖尿病組相比，胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用組的

13、EB含量均顯著降低。
　　6、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用保護(hù)血腦屏障的完整性
　　對照組的腦微血管內(nèi)皮間的緊密連接致密，處于關(guān)閉狀態(tài)，糖尿病組緊密連接處于輕微的開放狀態(tài)，胰島素組、艾迪苯醌組及聯(lián)合給藥組電鏡下的緊密連接均接近于對照組，處于關(guān)閉狀態(tài)。
　　7、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用上調(diào)糖尿病大鼠大腦微血管段occludin和claudin-5蛋白表達(dá)
　　與對照組比較，糖尿病組、胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯

14、醌聯(lián)合應(yīng)用組的大鼠腦微血管段occludin的表達(dá)均顯著降低;與糖尿病組相比較，胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用組分別顯著增加了occludin的表達(dá)。與對照組比較，糖尿病組、胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用組的大鼠腦微血管段claudin-5的表達(dá)均顯著降低;與糖尿病組相比較，胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用組分別顯著增加了claudin-5的表達(dá)。
　　二、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用對鏈

15、脲菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠血腦屏障的影響機(jī)制研究
　　1、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用降低糖尿病大鼠腦微血管段AGEs含量
　　與對照組相比，糖尿病組、胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用組的AGEs含量均顯著增加;與糖尿病組相比，胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用組的AGEs含量均顯著降低
　　2、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用降低糖尿病大鼠腦微血管段RAGE，NF-κB P65的蛋白表達(dá)
　　與對照組相

16、比，糖尿病組、胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用組的RAGE蛋白表達(dá)均顯著增加;與糖尿病組相比，胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用組的RAGE蛋白表達(dá)均顯著降低。與對照組相比，糖尿病組、胰島素組、艾迪苯醌組的NF-κB蛋白表達(dá)均顯著增加;與糖尿病組相比，胰島素組、艾迪苯醌組、胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用組的NF-κB蛋白表達(dá)均顯著降低。
　　結(jié)論:
　　1、胰島素與艾迪苯醌單獨(dú)以及聯(lián)合應(yīng)用分別顯著增加了糖

17、尿病大鼠的體重，降低了飲水量，胰島素及聯(lián)合應(yīng)用降低了糖尿病大鼠的血糖值。
　　2、胰島素與艾迪苯醌單獨(dú)以及聯(lián)合應(yīng)用分別顯著降低了糖尿病大鼠的血腦屏障通透性;胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用在降低糖尿病大鼠血腦屏障通透性上存在協(xié)同作用。
　　3、胰島素與艾迪苯醌單獨(dú)以及聯(lián)合應(yīng)用分別顯著增加了糖尿病大鼠的腦微血管段occludin和claudin-5的蛋白表達(dá)，胰島素與艾迪苯醌聯(lián)合應(yīng)用在增加緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin上存在協(xié)同作用