氧化應(yīng)激對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞Sonic hedgehog表達(dá)的影響以及小鼠急性心肌梗塞模型的制備.pdf

1、第一部分氧化應(yīng)激對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞Sonic hedgehog（Shh）表達(dá)的影響 目的：tedgehog家族是一類分泌信號(hào)蛋白，主要調(diào)節(jié)胚胎中多種器官和組織的形成。近年發(fā)現(xiàn)其與成年組織干細(xì)胞增殖、多種癌癥的形成有關(guān)。在小鼠中一共有三種hedgehog基因，分別是Sonic hedgehog（Shh），Indian hedgehog（Ihh）和Desert hedgehog（Dhh），由這三種基因編碼而成的信號(hào)都激動(dòng)同樣一條信號(hào)級(jí)聯(lián)

2、放大通路。Hh信號(hào)傳遞受靶細(xì)胞膜上兩種受體Patched（Ptc）和Smoothened（Smo）的控制。受體Ptc由腫瘤抑制基因Patched編碼，是由12個(gè)跨膜區(qū)的單一肽鏈構(gòu)成，能與配體直接結(jié)合，對(duì)Hh信號(hào)起負(fù)調(diào)控作用。受體Smo由原癌基因Smoothened編碼，與G蛋白偶聯(lián)受體同源，由7個(gè)跨膜區(qū)的單一肽鏈構(gòu)成，N端位于細(xì)胞外，C端位于細(xì)胞內(nèi)，Smo是Hh信號(hào)傳遞所必須的受體。當(dāng)Ptc和Hh結(jié)合以后，解除對(duì)Smo的抑制作用，促使G

3、li蛋白與Costal2，F(xiàn)used和Fused的抑制因子作用后與微管形成大分子復(fù)合物，使得全長(zhǎng)Gli蛋白進(jìn)入核內(nèi)激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄。已有研究表明Shh與許多血管生成因子有關(guān)，能促進(jìn)VEGF的表達(dá)，參與血管的生長(zhǎng)，對(duì)急、慢性心肌缺血模型以及缺血再灌注損傷模型有顯著治療作用；又有研究表明HH在動(dòng)物糖尿病模型中陰莖海綿體、神經(jīng)、血管等組織中表達(dá)下降，并參與糖尿病模型神經(jīng)及其滋養(yǎng)血管的修復(fù)和皮膚傷口的愈合。之前的研究已經(jīng)證實(shí)了糖尿病小鼠心肌組

4、織中Shh表達(dá)下降，但其下降的原因還未可知，由于糖尿病病程中氧化應(yīng)激發(fā)揮作用已經(jīng)成為了一個(gè)不爭(zhēng)的事實(shí)，所以本課題主要探討氧化應(yīng)激是否能導(dǎo)致心肌細(xì)胞中Shh信號(hào)蛋白表達(dá)的降低。 方法：選用原代培養(yǎng)的新生SD大鼠心肌細(xì)胞。用RT-PCR方法檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)ShhmRNA表達(dá)的變化：Western blot法檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)Shh蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果： 1．使用黃嘌呤氧化酶/黃嘌呤（xo/x）濃度分別為xo（0．5u/L

5、）/x（0．5mM）和xo（1u/L）/x（0．5mM）作用于心肌細(xì)胞24小時(shí)后，提取心肌細(xì)胞總RNA，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Shh mRNA表達(dá)的變化。以管家基因GAPDH為內(nèi)參，與正常對(duì)照組相比，不同濃度的xo/x分別使心肌細(xì)胞內(nèi)ShhmRNA表達(dá)降低40．1％和59．2％。另外在氧化應(yīng)激的基礎(chǔ)上（xo（1u/L）/x（0．5mM））給予0．1mM和0．5mM抗氧化劑tempol共同孵育24小時(shí)，同樣檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Shh mRNA表達(dá)的變化。以管家

6、基因GAPDH為內(nèi)參，與單純氧化應(yīng)激組相比，不同濃度的tempol分別使心肌細(xì)胞內(nèi)Shh mRNA表達(dá)上升7．4％和45．2％。 2．使用黃嘌呤氧化酶/黃嘌呤（xo/x）濃度分別為xo（0．5u/L）/x（0．5mM）和xo（1u/L）/x（0．5mM）作用于心肌細(xì)胞24小時(shí)后，提取心肌細(xì)胞總蛋白，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Shh蛋白表達(dá)的變化。以管家基因GAPDH蛋白為內(nèi)參，與正常組對(duì)照組相比，不同濃度的xo/x分別使心肌細(xì)胞內(nèi)Shh蛋白表達(dá)

7、降低19％和38．6％。另外在氧化應(yīng)激的基礎(chǔ)上（xo（1u/L）/x（0．5mM））給予0．1mM和0．5mM抗氧化劑tempol共同孵育24小時(shí)，同樣檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Shh蛋白表達(dá)的變化。以管家基因GAPDH蛋白為內(nèi)參，與單純氧化應(yīng)激組相比，不同濃度的tempol分別使心肌細(xì)胞內(nèi)Shh蛋白表達(dá)上升0．08％和24．4％。 結(jié)論：氧化應(yīng)激系統(tǒng)（黃嘌呤氧化酶/黃嘌呤）刺激心肌細(xì)胞，導(dǎo)致Shh mRNA和蛋白表達(dá)降低，用tempol抗氧化

8、保護(hù)可以抑制氧化應(yīng)激系統(tǒng)造成的Shh mRNA和蛋白表達(dá)降低。由此可見，氧化應(yīng)激直接導(dǎo)致心肌細(xì)胞中Shh表達(dá)下降。 第二部分小鼠急性心肌梗塞模型的制備 目的：大量臨床研究表明，糖尿病與心力衰竭之間有著獨(dú)立密切的聯(lián)系，不僅表現(xiàn)在糖尿病患者同時(shí)患心力衰竭的機(jī)率遠(yuǎn)大于非糖尿病患者，還表現(xiàn)在糖尿病患者同時(shí)患上心肌梗塞后，其修復(fù)速度遠(yuǎn)小于非糖尿病患者。已有研究表明，在小鼠急性心梗模型中Shh的表達(dá)是增加的，且Shh對(duì)急、慢性心肌缺

9、血模型以及缺血再灌注損傷模型有顯著的修復(fù)治療作用。我們之前的研究已經(jīng)證實(shí)，糖尿病小鼠心肌組織中Shh表達(dá)降低，因此，建立小鼠急性心肌梗塞模型可以進(jìn)一步研究糖尿病小鼠心肌組織中Shh表達(dá)降低的意義。 方法：結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支制造小鼠急性心肌梗塞模型。心肌梗塞兩周后，通過形態(tài)學(xué)觀察、檢測(cè)左室收縮末內(nèi)徑（LVED；s）、左室舒張末內(nèi)徑（LVED；d）、左室短軸縮短分?jǐn)?shù)（FS％）、射血分?jǐn)?shù)（EF％）、左室收縮期前壁厚度（LNAW；s）

10、、后壁厚度（INPW；s），左室舒張期前壁厚度（LNAW；d）、后壁厚度（LVPW；d）來(lái)確認(rèn)心肌梗塞模型的成功。 結(jié)果： 1．形態(tài)學(xué)觀察：將正常組兩周和心梗組兩周的心臟取出，經(jīng)過處理取像后觀察左室前壁厚度、顏色和心室腔大小，結(jié)果顯示心梗組兩周的左室前壁變薄、顏色變白，且室腔擴(kuò)大明顯。 2．超聲心功能評(píng)價(jià)：應(yīng)用實(shí)時(shí)超聲成像系統(tǒng)Vevo770（Visualsonics）于術(shù)前及術(shù)后兩周行經(jīng)胸超聲檢查。結(jié)果顯示心梗組

11、兩周的左室前壁明顯變薄，且心室腔明顯擴(kuò)大。心梗組兩周的左室收縮期和舒張期前壁厚度（LVAW；s、LVAW；d）、左室射血分?jǐn)?shù)（EF％）、左心室短軸縮短率（FS％）、心輸出量（CO）分別比正常組兩周時(shí)低70％、53．8％、65．15％、71．08％、47．12％，左心室收縮末期內(nèi)徑（LVID；s）、舒張末期內(nèi)徑（LNID；d）分別比正常組兩周時(shí)高67．5％、15．6％；心梗組術(shù)前與正常組術(shù)前上述各指標(biāo)比較沒有明顯變化。 結(jié)論：形態(tài)