LIGHT-LTβR信號通路在NOD小鼠中的作用.pdf

1、1型糖尿?。═ype1 diabetes mellitus, T1DM）是一種以長期慢性炎癥和胰島β細胞大量損傷而導致胰島素分泌不足，引起機體糖脂代謝紊亂為特征的器官特異性自身免疫疾病。T1DM的發(fā)病率呈逐年遞增趨勢，其嚴重的并發(fā)癥已成為兒童、青少年致殘和早亡的重要因素。因此，T1DM是當今急需解決的健康問題之一。引起T1DM的因素多而復雜，其中T細胞持續(xù)活化而導致胰島β細胞損傷是 T1DM病情發(fā)展中的重要一環(huán)。T細胞中的CD8+T細胞

2、致β細胞死亡的作用已有深入研究，但由 CD4+T細胞或巨噬細胞等產生的細胞因子，尤其是參與T細胞活化的共刺激分子在該病中的作用機制仍不是很清楚。深入研究導致 T細胞活化的共刺激分子在β細胞免疫損傷中的作用機制，對于發(fā)展有效的T1DM防治策略具有重要的理論意義和實際價值。
　　早期的研究發(fā)現合理封閉一些共刺激途徑可以降低 T1DM的發(fā)生。LIGHT-HVEM/LTβR是20世紀末發(fā)現的共刺激分子，多個研究小組報道 LIGHT信號通路

3、通過參與T細胞的活化，誘導細胞凋亡等在類風濕性關節(jié)炎和自身免疫性肝炎等多種自身免疫疾病的病理發(fā)生中起著積極的作用。已有報道認為，LIGHT-LTβR信號途徑可促進胰腺內淋巴結的發(fā)育而募集活化 T淋巴細胞對β細胞造成免疫損傷而導致糖尿病的產生；用 LTβR-Ig治療NOD小鼠，早期給藥可預防胰島炎和TIDM的發(fā)生，胰島炎晚期給藥可逆轉胰島炎和延緩糖尿病發(fā)生，提示LIGHT信號通路在 TIDM的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。但 LIGHT信號通

4、路在T1DM的胰島細胞凋亡中的直接作用及相關分子機制，尚未見報道。
　　針對上述研究現狀，本課題結合現代分子遺傳學、細胞學和免疫學等學科的前沿技術與方法，以LIGHT-/-NOD小鼠為模式動物和以MIN6細胞株為主要細胞模型，從在體（in vivo）和離體（in vitro）等多個方面，探討LIGHT信號通路在T1DM發(fā)生、發(fā)展中的作用及機制，擬解決以下幾個問題：1、動態(tài)檢測 NOD小鼠胰組織LIGHT及其受體HVEM、LTβR的

5、表達以及外周血中相關細胞因子的分泌情況，探討LIGHT信號通路以及有關細胞因子的分泌與T1DM病情發(fā)展的相關性；2、建立LIGHT-/- NOD小鼠動物模型，通過生化指標檢測、胰腺病理分析、小鼠糖尿病發(fā)病情況統(tǒng)計、細胞因子分泌等觀察LIGHT信號缺失（LIGHT-/-NOD小鼠）時，NOD小鼠糖尿病病情變化。通過對比分析，明確 LIGHT途徑在胰島β細胞免疫損傷中的作用；3、以NOD小鼠胰島素瘤細胞株MIN6和Bal b/c小鼠的原代胰

6、島細胞為模型，分別用rmLIGHT和rmIFN-γ單獨或聯合處理細胞，利用MTT、FCM等技術觀察LIGHT途徑對胰島細胞存活及凋亡的影響；4、采用Western blot或免疫細胞化學等技術檢測目標基因（STAT1、NF-κB、Bcl-2家族、Caspase家族、PARP等）的蛋白表達水平，研究闡明 LIGHT信號通路誘導胰島β細胞凋亡的分子機制。預期的研究結果不但有助于闡明胰島β細胞的有關損傷機制，并且可為T1DM的臨床治療研究提供

7、新的思路和方法。
　　第一部分，LIGHT及受體的表達隨NOD小鼠糖尿病病情發(fā)展的變化
　　目的：探討LIGHT及受體HVEM、LTβR的表達以及細胞因子IFN-γ和IL-4的分泌變化與T1DM發(fā)生、發(fā)展的關系。
　　方法：4周齡雌性NOD小鼠（n=30）飼養(yǎng)于SPF級動物房，在無任何干預條件下，定期監(jiān)測血糖、胰島素水平。一周內連續(xù)兩次檢測非空腹血糖水平≥13.8mmol/L的小鼠診斷為糖尿病，觀察NOD小鼠自發(fā)產生糖

8、尿病的情況；分別隨機取未產生糖尿病、糖尿病發(fā)病1周、糖尿病發(fā)病2周、糖尿病發(fā)病4周的NOD小鼠各3只，處死收集血清并提取小鼠胰腺總RNA和總蛋白，采用Real-time PCR和Western blot技術檢測LIGHT及其受體HVEM、LTβR的表達；ELISA法檢測血清炎癥相關細胞因子（IFN-γ、IL-4）分泌。
　　結果：30周齡時，NOD小鼠糖尿病累積發(fā)病率為81.5％（22/27）；Real-time PCR

9、和Western blot結果顯示，糖尿病發(fā)病4周的NOD小鼠胰腺組織LIGHT、LTβR和HVEM的表達較未產生糖尿病組明顯上調（P<0.05）。血清中Th1細胞因子IFN-γ分泌明顯增加，而Th2細胞因子IL-4分泌減少。
　　結論：NOD小鼠發(fā)生糖尿病時，LIGHT、LTβR和HVEM表達明顯上調，血清中促炎癥細胞因子IFN-γ分泌增加，抑制炎癥細胞因子IL-4分泌減少，上述因素與T1DM的發(fā)生發(fā)展相關。
　　第二部分

10、，LIGHT途徑信號缺失對NOD小鼠糖尿病病情的影響
　　目的：觀察LIGHT信號缺失時NOD小鼠（LIGHT-/-NOD小鼠）糖尿病病情變化，通過對比分析明確LIGHT途徑在胰島β細胞損傷中的作用。
　　方法：將LIGHT-/-（LIGHT KO）小鼠與NOD小鼠進行配對得到LIGHT+/-NOD子代，再將其與NOD小鼠連續(xù)回交十代以上，LIGHT+/-NOD子代再自交，即可得到LIGHT-/-NOD小鼠。4周齡LIGHT

11、-/-NOD小鼠（n=25）和對照同齡NOD小鼠（LIGHT＋/＋NOD小鼠）（n=25）飼養(yǎng)26周，動態(tài)檢測2組小鼠的體重、血糖，利用腹腔注射葡萄糖耐量試驗（Intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT）分析小鼠體內胰島素活性情況，并統(tǒng)計小鼠的糖尿病累積發(fā)病率。兩組隨機取11周齡和20周齡小鼠各5只處死，收集血清，采用ELISA法檢測血清細胞因子IFN-γ、IL-4的分泌；HE法染色胰腺組

12、織對胰島炎進行分級；胰島原位細胞凋亡檢測技術（TUNEL法）觀察胰島細胞凋亡情況。
　　結果：LIGHT-/-NOD小鼠與LIGHT+/+NOD小鼠相比，糖尿病的累積發(fā)病率顯著降低（LIGHT-/-NOD組：13.3％，2/15；LIGHT+/+NOD組：73.3％，11/15）；LIGHT-/-NOD小鼠腹腔注射葡萄糖耐量試驗無異常，而對照組 IPGTT明顯減退；LIGHT-/-NOD小鼠胰島絕對數目明顯多于對照組，胰島炎以零級

13、、一級為主，對照組胰島炎以二至四級為主；LIGHT-/-NOD小鼠未見明顯的胰島細胞凋亡；LIGHT-/-NOD小鼠血清中，與1型糖尿病的發(fā)病機制密切相關的炎性細胞因子IFN-γ水平顯著低于對照組，保護β細胞的抑制炎癥細胞因子IL-4水平稍高于對照組。
　　結論：（1）LIGHT信號通路信號缺失時可降低炎性細胞因子IFN-γ的分泌，改善NOD小鼠的胰島炎癥；（2）LIGHT信號缺失時可減輕胰島細胞凋亡程度，改善葡萄糖耐量異常，降低

14、 NOD小鼠糖尿病的發(fā)病率。
　　第三部分，LIGHT-LTβR信號通路對胰島細胞凋亡的影響
　　目的：探討LIGHT是否直接參與炎性細胞因子誘導的胰島細胞凋亡。
　　方法：培養(yǎng) NOD小鼠胰島素瘤 MIN6細胞株和原代胰島細胞。分別用rmLIGHT和rmIFN-γ單獨或聯合處理細胞，以rmTNF-α為陽性對照。采用MTT法檢測細胞存活情況；Hoechst33258染色細胞核，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞核形態(tài)變化；FCM

15、檢測細胞凋亡百分率；DNA ladder電泳檢測細胞DNA的片段化等，以此分析LIGHT對胰島細胞凋亡的影響。運用抗LTβR或HVEM多抗阻斷LIGHT途徑，用MTT和FCM法觀察胰島細胞活力和凋亡的變化，進一步明確LIGHT途徑對胰島細胞凋亡的影響。
　　結果：LIGHT或 IFN-γ單獨作用時，僅對胰島細胞產生輕微的毒性作用，但 LIGHT聯合 IFN-γ處理細胞，兩者的作用增強具有協同性且呈時間依賴性地明顯抑制了細胞活力。M

16、IN6細胞經 LIGHT和IFN-γ聯合處理后，細胞形態(tài)由不規(guī)則瓦片狀變圓甚至漂浮，細胞密度顯著降低；細胞核固縮、呈致密濃染，出現凋亡小體；細胞核內基因組 DNA出現明顯的片段化；細胞早期凋亡率顯著增加，但壞死或晚期凋亡率變化不明顯。運用抗 LTβR的多抗阻斷 LIGHT途徑后，能明顯增加胰島細胞的活力，降低 LIGHT聯合 IFN-γ誘導的細胞凋亡率。
　　結論：LIGHT主要結合受體LTβR，直接參與了炎癥細胞因子IFN-γ誘

17、導的胰島細胞凋亡；LIGHT與IFN-γ的作用存在協同效應。
　　第四部分，LIGHT-LTβR信號通路誘導胰島細胞凋亡的分子機制
　　目的：探討LIGHT-LTβR通路介導的胰島細胞凋亡中所涉及的下游基因表達變化，進一步明確LIGHT途徑致胰島細胞凋亡的分子機制。
　　方法：培養(yǎng)NOD小鼠胰島素瘤MIN6細胞株，分別用rmLIGHT和rmIFN-γ單獨或聯合處理細胞，采用Western blot或免疫細胞化學等技術檢

18、測轉錄因子NF-κB和STAT1的蛋白表達水平；檢測線粒體內Cyto C的釋放；分析凋亡調節(jié)因子Bcl-2家族（Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Bak和Bid）以及凋亡執(zhí)行者Caspase家族（Caspase-3,-8,-9）和Caspase作用底物PARP等基因在不同時相點的蛋白表達變化。分別利用NF-κB、STAT1、Caspase、Caspase-3的特異抑制劑 PDTC、Fludarabine、Z-VAD-FMK、Ac-DEV

19、D-CHO預先處理細胞影響信號傳遞，再用相應細胞因子處理，MTT、FCM等技術檢測細胞的存活或凋亡情況，Western blot技術檢測Bcl-2家族主要成員的蛋白表達變化；利用Caspase-3活性測定試劑盒檢測Caspase-3活性。免疫組織化學法觀察LIGHT-/-NOD小鼠胰島細胞內Bax的表達和Caspase-3的活化情況。
　　結果：LIGHT聯合IFN-γ作用于MIN6細胞，能明顯激活轉錄因子NF-κB和STAT1；

20、凋亡調控因子Bcl-2家族的抗凋亡成員Bcl-XL表達下調，促凋亡成員Bak和Bax上調；凋亡執(zhí)行者Caspase家族成員Caspase-3,-8,-9被剪切活化，Caspase作用底物PARP被裂解失活；NF-κB、STAT1的特異抑制劑PDTC、Fludarabine逆轉了由細胞因子誘導的Bcl-XL的表達下調和Bax、Bak的表達上調，細胞活力明顯增強。LIGHT-/-NOD小鼠胰島細胞內Bax表達下調，Caspase-3的活化被