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文檔簡介
1、目的:
炎癥性腸病(IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD),到目前為止,該病的病因及發(fā)病機制尚未闡明,治療缺乏特異性,沒有治愈的方法,目前免疫異常被公認為在IBD的發(fā)病過程中具有極為重要的作用,而白細胞介素(IL)是其中最主要的具有多種生物活性的一組淋巴因子,本研究通過對IBD患者腸黏膜中IL-17、IL-23表達的研究,探討IBD患者腸黏膜IL-17、IL-23的表達及與疾病的關(guān)系。
材料和方法
2、
一、一般資料
選擇中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院2003年10月至2007年4月保存有完整資料的診斷明確的CD及同期UC住院患者活動期病變部位腸黏膜活檢或手術(shù)標(biāo)本,活動期CD組和UC組分別為8例和20例,正常對照20例。IBD的臨床診斷均依據(jù)于典型的臨床表現(xiàn)、常規(guī)影像學(xué)、內(nèi)鏡學(xué)及組織學(xué)標(biāo)準。
二、主要試劑
1、兔抗人IL-17、IL-23單克隆抗體
2、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)
3、顯色試劑盒
3、免疫組化過氧化物酶標(biāo)志的鏈霉卵白素(SP)試劑盒顯色試劑盒
三、實驗方法
免疫組化檢測:免疫組化染色采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶連接(S—P)法。標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋。全部蠟塊均行4μm厚連續(xù)切片,常規(guī)脫蠟至水,室溫下3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶,微波修復(fù)抗原;滴加一抗(兔抗人IL-17、兔抗人IL-23,1:80,),4℃冷藏過夜后滴加二抗(山羊抗兔
4、IgG,),于室溫下孵育30分鐘;DAB顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹膠封片。
四、結(jié)果判定
腸上皮細胞IL-17、IL-23染色結(jié)果評價參照文獻進行[5],IL—17、IL-23染色為細胞質(zhì)染色:組織切片中顯示細胞質(zhì)染為淡黃色至黃棕色者為陽性細胞標(biāo)志,將陽性細胞按其數(shù)量及顯色強度分為3級:表達弱陽性(+),即陽性細胞數(shù)<10%,顯色強度為淡黃色或僅個別細胞呈黃至棕黃色染色;表達強陽性(+++),即陽性細胞數(shù)>60
5、%,多數(shù)細胞呈黃至棕黃色染色;表達中度陽性(++),即陽性細胞數(shù)及顯色強度介于弱陽性與強陽性之間。凡顯色強度與背景無明顯差別者為陰性。腸黏膜固有層內(nèi)IL—17、IL—23表達以計數(shù)1000倍高倍鏡下5個視野內(nèi)平均陽性細胞百分數(shù)。上述結(jié)果均由兩人雙盲法獨立判斷,取其平均值。
五、統(tǒng)計學(xué)處理
實驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行秩和檢驗及t檢驗,以p<0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果:
6、r> 腸黏膜IL—17、IL—23免疫組化染色顯示,IBD患者結(jié)腸上皮細胞陽性為細胞質(zhì)著色;黏膜固有層和淋巴小結(jié)內(nèi)也可見散在陽性細胞。比較活動期UC、CD患者腸黏膜上皮細胞IL—17、IL—23表達,發(fā)現(xiàn)UC患者IL—17、IL—23陽性染色強度均高于CD患者,但二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(μ值分別為0.426、0.512,p值均>0.01)。二者分別與正常對照組比較,均見顯著性差異,其中UC組與正常對照組比較,IL—17、IL—23陽
7、性染色強度均高于對照組,二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(μ值分別為4.898、4.513,p值均<0.01)。CD組與正常對照組比較,IL—17、IL—23陽性染色強度亦均高于對照組,二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(μ值分別為3.251、3.316,p值均<0.01)。比較活動期UC、CD患者腸黏膜固有層內(nèi)陽性細胞百分數(shù),發(fā)現(xiàn)UC患者IL—17陽性細胞百分數(shù)高于CD患者,而IL—23陽性細胞百分數(shù)低于CD患者,但二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為1.599、
8、1.825,p值均>0.01);二者分別與正常對照組比較,均見顯著性差異,其中UC組與正常對照組比較,IL—17、IL—23腸黏膜固有層內(nèi)陽性細胞百分數(shù)均高于對照組,二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為9.691、12.542,p值均<0.01)。CD組與正常對照組比較,IL—17、IL—23腸黏膜固有層內(nèi)陽性細胞百分數(shù)亦均高于對照組,二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為2.891、8.298,p值均<0.01)。
討論:
9、 IBD在西方國家相當(dāng)常見,近年我國報道的病例明顯增多。目前普遍認為IBD的發(fā)病機制與遺傳易感宿主對腸道菌叢的免疫應(yīng)答失常有關(guān),其中免疫調(diào)節(jié)異常和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是IBD研究最活躍的領(lǐng)域。
Th17細胞是新近發(fā)現(xiàn)的一群效應(yīng)性CD4+T輔助細胞亞群,其具高致病性,IL—17是一種促炎癥細胞因子,是Th17細胞的主要效應(yīng)因子,它具有強大的募集和激活嗜中性粒細胞能力。此外,IL—17還可與炎癥因子TNF2α等有協(xié)同作用,放
10、大加強其致炎效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn),活動期的IBD患者,UC和CD組結(jié)腸粘膜組織中IL—17高表達,而在正常對照組結(jié)腸粘膜組織中IL-17很少表達,提示在IBD患者結(jié)腸局部浸潤的淋巴細胞中可能有Th-17細胞的存在。IL—23是與IL—12密切相關(guān)的細胞因子,由相同的p40亞基分別與p35、p19構(gòu)成,IL—23驅(qū)動Th17細胞擴增及維持其存活,缺乏IL—23時,Th17細胞即明顯減少。早期的IL—23功能學(xué)研究發(fā)現(xiàn)IL—23才是自身免疫性疾
11、病的真正病因。本研究發(fā)現(xiàn),活動期的IBD患者,UC和CD組結(jié)腸粘膜組織中IL—23高表達,而在正常對照組結(jié)腸粘膜組織中IL—23很少表達,提示IL—23參與了IBD患者結(jié)腸粘膜炎癥反應(yīng)。
總之,本研究顯示,活動期IBD患者腸粘膜IL—23、IL—17的表達較正常對照均有顯著增強,提示IL—23、IL—17在IBD發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。IL—23通過誘導(dǎo)并驅(qū)動Th17細胞產(chǎn)生IL—17、IL—6和TNF2α,引起結(jié)腸炎
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