白細胞介素-27抑制炎癥作用的機制研究.pdf

1、本論文分為兩個部分，分別研究了白細胞介素-27對腸炎相關腸癌的保護作用和白細胞介素-27對小鼠肥胖模型的調(diào)控作用及其機制。
　　第一部分白細胞介素-27通過抑制腸上皮細胞分泌的促炎因子對腸炎相關腸癌的保護作用
　　炎癥和癌癥的相關性一直是腫瘤免疫的研究重點之一，以往的結果表明，長期的炎性環(huán)境會加速腫瘤的形成。腸炎相關腸癌是一種典型的炎癥相關腫瘤，長期的腸道炎癥導致腸上皮的不斷破壞和修復，長此以往加速了相關癌癥相關基因的突變頻

2、率和腫瘤細胞的增殖。白細胞介素-27（Interleukin-27，IL-27）由p28和EBI3兩個亞基組成，主要由活化的抗原遞呈細胞分泌，其受體由gp130和WSX-1兩個亞基組成，表達于多種免疫細胞、上皮細胞及內(nèi)皮細胞表面。已有文獻報道，IL-27在各種炎癥相關的疾病中發(fā)揮調(diào)控功能，并且在不同疾病模型中針對不同靶細胞兼有抑炎和促炎兩方面的作用。在腸炎的研究中，IL-27的功能也尚有爭議，兼有其促進腸炎和抑制腸炎的報道，并且目前尚未

3、有關于IL-27在腸炎相關腸癌中功能的報道。因此，本文通過建立由AOM/DSS誘導的腸炎相關腸癌(colitis-associated cancer)小鼠模型，研究IL-27對腸癌發(fā)生發(fā)展的作用，以期為炎癥與癌癥的關系研究提供相關的理論依據(jù)，為腫瘤微環(huán)境中的細胞因子的作用增添新的認識。
　　我們首先用野生C57BL/6小鼠成功構建了AOM/DSS模型，取小鼠結直腸腫瘤和癌旁組織，及健康小鼠結直腸組織，通過熒光定量PCR(Q-PCR

4、)、Western Blot以及免疫熒光等手段檢測到IL-27的兩個亞基及其特異性受體亞基WSX-1在腫瘤組織局部表達升高，并且IL-27主要在腸道固有層細胞中表達。隨后，我們使用IL-27R受體亞基WSX-1敲除的(WSX-1 KO)小鼠和野生(WT)小鼠同時構建AOM/DSS模型，結果發(fā)現(xiàn)與野生小鼠相比，WSX-1 KO小鼠腸道腫瘤載量和數(shù)目明顯增多，局部的腫瘤細胞增殖加強，并且伴隨著促炎因子升高、腸道長度縮短等更嚴重的腸道炎癥指標

5、。
　　為研究上述結果的機制，基于我們在WT和WSX-1 KO小鼠組織中觀察到了不同的炎癥程度，我們進一步使用流式細胞術檢測了腸癌模型小鼠的腸道固有層細胞中的免疫細胞亞群的分布和變化，結果顯示促腫瘤生長的髓系來源抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)在WSX-1 KO小鼠的腸道中明顯聚集增加，但其表面關鍵趨化因子受體CXCR2的表達并沒有明顯變化。我們進一步檢測了腸上皮細胞中的趨

6、化因子和促炎因子的表達，發(fā)現(xiàn)在WSX-1 KO腸癌模型小鼠的腸上皮中，除CXCR2的配體CXCL1的表達明顯升高以外，促炎因子IL-6，TNF-α，GM-CSF的水平也有了明顯升高，提示了IL-27對腸上皮細胞可能發(fā)揮的抑炎作用。同時，免疫熒光實驗也證明腫瘤局部CXCL1的下降與MDSCs數(shù)量的減少是一致的，提示腸上皮細胞來源的CXCL1增加可能是MDSCs數(shù)量增加的原因。隨后我們在體外證明，使用中和抗體封閉了上皮細胞來源的CXCL1后

7、，MDSCs的遷移減少;同時將IL-6和GM-CSF的中和抗體加入小鼠腸上皮來源的腫瘤細胞系CT26和MDSCs的共培養(yǎng)體系后，MDSCs的數(shù)量減少，證明腸上皮細胞來源的IL-6和GM-CSF促進MDSCs的存活。
　　隨后我們用熒光定量PCR和免疫熒光檢測了WT和WSX-1 KO腫瘤建模小鼠的腸道緊密連接蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)沒有明顯統(tǒng)計學差異，并且血清中LPS也沒有明顯變化，證明促炎因子的變化不是由于局部來源于腸道菌群的病原相關模式

8、分子（Pathogen-associated Molecular Pattern，PAMPs）的數(shù)量變化導致的，而可能直接由腸上皮細胞的反應性變化引起。因此我們進一步用LPS和IL-27在體外刺激了原代腸上皮細胞，發(fā)現(xiàn)IL-27可抑制LPS誘導的腸上皮細胞中促炎因子和趨化因子的分泌。最后，我們用抗生素組合喂食小鼠，清除腸道內(nèi)微生物來源的PAMPs后，再用AOM/DSS誘導腫瘤模型，我們發(fā)現(xiàn)在清除了微生物來源的PAMPs后，WT和WSX-

9、1 KO模型小鼠腸道腫瘤、腸道固有層MDSCs數(shù)量、腸上皮細胞促炎因子和趨化因子的表達均無統(tǒng)計學差異，證明IL-27對腸炎相關腸癌的保護作用是依賴PAMPs的。
　　綜上，本部分研究證明在慢性腸炎相關的腸癌模型發(fā)病過程中，IL-27可以抑制PAMPs觸發(fā)的腸上皮細胞中促炎因子和趨化因子的表達，從而降低了促腫瘤的髓系來源抑制細胞(MDSCs)的聚集，因此對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到抑制作用。本研究為闡明腫瘤微環(huán)境中細胞因子的調(diào)控作用增添了新

10、的理論依據(jù)，也可能為腸癌的免疫治療提供新的思路。
　　第二部分白細胞介素-27受體敲除促進小鼠肥胖及其機制的初步研究
　　肥胖是現(xiàn)代社會危害人類健康的隱形殺手之一，它所引發(fā)的代謝病癥長久以來困擾著人們的身體健康。我們對脂肪功能的認識，也逐漸從簡單存儲能量，到作為內(nèi)分泌系統(tǒng)的一部分調(diào)節(jié)人體代謝功能。內(nèi)臟脂肪的含量和狀態(tài)，對健康有著非常重要的影響。隨著研究的深入，肥胖被認為是一種慢性炎癥狀態(tài)，脂肪組織，特別是內(nèi)臟脂肪組織（vis

11、ceral adipose tissue，VAT）分泌的各種促炎因子如IL-6、TNF-α和C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）等在肥胖狀態(tài)下均表達上升，導致胰島素抵抗等相關表現(xiàn)。近年來發(fā)現(xiàn)，內(nèi)臟脂肪組織中存在一種特殊的調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)，脂肪Treg通過分泌IL-10和TGF-β對脂肪代謝的穩(wěn)態(tài)起到重要調(diào)節(jié)作用。正常狀態(tài)Treg細胞在脂肪中聚集，VAT Treg占CD4+T細胞的比例高于其他淋巴器官和非淋

12、巴器官，而在肥胖狀態(tài)下，Treg細胞比例在脂肪組織中急劇下降。
　　在進行第一部分實驗的時候，我們發(fā)現(xiàn)在較大年齡（24周以上）的小鼠中，WSX-1 KO小鼠體重略高于WT小鼠，同時查閱文獻發(fā)現(xiàn)以往并沒有IL-27在肥胖中的作用研究，因此進行了第二部分實驗。
　　WSX-1 KO和WT小鼠給予正常飲食飼養(yǎng)在同樣環(huán)境下24周后，我們首先檢測其體重變化，發(fā)現(xiàn)WSX-1 KO小鼠體重相較于WT小鼠有明顯增加，并且內(nèi)臟脂肪的重量也有明

13、顯上升，流式檢測結果表明WSX-1 KO小鼠中VAT Treg數(shù)量下降。這些結果提示了IL-27受體敲除可促進小鼠肥胖。隨后，我們進一步用高脂飼料誘導肥胖模型，得到同樣結果。在喂養(yǎng)過程中，雖然兩組進食量并沒有差距，但是WSX-1 KO小鼠的體重高于WT小鼠，核磁共振結果顯示其體脂含量也高于WT小鼠，并且WSX-1 KO小鼠中VATTreg數(shù)量也顯著降低，VAT Treg的相關轉錄因子Foxp3和PPAR-γ mRNA水平在內(nèi)臟脂肪中的含

14、量也顯著下降，這些結果進一步證明，在高脂飲食誘導的肥胖模型中，IL-27/WSX-1信號也可以對肥胖發(fā)揮抑制作用。為了解這種現(xiàn)象是否具有臨床相關性，我們進一步用ELISA檢測了肥胖患兒血漿中的IL-27含量，但有趣的是，發(fā)現(xiàn)跟對照組相比，肥胖兒童血漿中IL-27含量升高，我們推測IL-27可能是以一種代償效應發(fā)揮作用，在肥胖狀態(tài)下應激分泌。具體機制還有待于進一步深入研究。
　　綜上所述，本部分研究我們初步發(fā)現(xiàn)了IL-27/WSX-