胃癌相關(guān)性分子標(biāo)記物的研究.pdf

1、目的:本研究擬從CDH1基因序列再測序、miRNA表達(dá)及微衛(wèi)星片段分析三個(gè)角度研究探討胃癌的相關(guān)性分子標(biāo)記物，并探討研究方法的可行性，為進(jìn)一步深入研究胃癌的機(jī)制提供參考。 方法 CDH1基因序列再測定的研究抽提漢族胃癌腫瘤組織和對(duì)應(yīng)正常胃粘膜組織的基因組DNA，抽取正常健康人外周血基因組DNA。采用Applied Biosystems公司的CDh1基因再測序引物，分別進(jìn)行PCR。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物純

2、化后再進(jìn)行測序反應(yīng)。NaAC/EDTA法進(jìn)行測序反應(yīng)產(chǎn)物純化。甲酰胺變性，上測序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳。電腦軟件自動(dòng)采集信號(hào)、分析原始并讀出序列圖譜。采用SeqScape v 2.1.1軟件進(jìn)行序列比對(duì)，尋找基因變異位點(diǎn)。 miR-21、miR-145及miR-155的表達(dá)提取石蠟包埋的腫瘤組織和正常胃組織的總RNA，采用美國Applied Biosystems公司設(shè)計(jì)的特異莖環(huán)狀引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以U6為內(nèi)參照基因，實(shí)時(shí)定量PCR

3、技術(shù)檢測miR-21、miR-145和miR-155的表達(dá)。根據(jù)實(shí)時(shí)獲得的反應(yīng)初始濃度的Ct值，分別計(jì)算各樣本的ΔCt值，再以2-ΔCt值進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。 微衛(wèi)星不穩(wěn)定研究提取凍存的胃癌組織和正常對(duì)照組織的基因組DNA。采用多重?zé)晒釶CR方法，在同一管內(nèi)進(jìn)行D2S123、D17S250、D5S346、Bat-25和Bat-26五個(gè)引物對(duì)的PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物變性后，在ABl3100測序分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。采用GeneMap

4、per 3.0軟件進(jìn)行比對(duì)、判讀微衛(wèi)星不穩(wěn)定。 BAT25的調(diào)查性測序研究提取健康人群的基因組DNA進(jìn)行BAT25的測序分析，調(diào)查BAT25在漢族人群中的真實(shí)數(shù)據(jù)情況，為病理診斷MSI提供參考依據(jù)。 結(jié)果： CDH1基因序列再測定的研究1)在散發(fā)性胃癌中發(fā)現(xiàn)11個(gè)CDH1基因變異位點(diǎn)，其中-49位點(diǎn)G>T突變?yōu)樾掳l(fā)現(xiàn)變異。-1030位點(diǎn)的A基因型和-284位點(diǎn)的A基因型與散發(fā)性胃癌的低分化顯著相關(guān)。 2)

5、在家族性胃癌成員中除發(fā)現(xiàn)散發(fā)性胃癌具有的變異外，另外發(fā)現(xiàn)8處新突變，均未見報(bào)道。這8處位點(diǎn)都位于鄰近編碼區(qū)的內(nèi)含子處。miR-21、miR-145及miR-155的表達(dá)1)miR-21和miR-145在胃癌和正常胃黏膜組織中的表達(dá)豐度高于miR-155在正常胃組織和腫瘤組織中的表達(dá)豐度。 2)胃癌組織的miR-21表達(dá)顯著高于正常組織的miR-21表達(dá)。 3)胃癌組織的miR-155表達(dá)顯著高于正常組織的miR-155表

6、達(dá)。 4)miR-145在腫瘤組織中的表達(dá)與正常組織無顯著性差異，但總體來看，其在腫瘤中的表達(dá)低于正常組織。 微衛(wèi)星不穩(wěn)定研究1)MSI胃癌在檢測的散發(fā)性胃癌中陽性率達(dá)到35.1％，與文獻(xiàn)報(bào)道的陽性率類似。五個(gè)位點(diǎn)中，BAT25在MSI中的陽性率最高，為85.0％；其次為BAT26，為45.0％；發(fā)生頻率最低的位點(diǎn)是D17S250(5.0％)。 2)MSI胃癌與MSS胃癌在性別、腫瘤分化程度、組織學(xué)分類、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)

7、移、臨床分期及TNM分期、Hp感染等方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但MSI與MSS胃癌在年齡方面表現(xiàn)一定的差異。另外，MSI胃癌與hMSH2的低蛋白表達(dá)相關(guān)。 BAT25的調(diào)查性測序研究1)BAT25在健康漢族人群中表現(xiàn)為單堿基準(zhǔn)單態(tài)性。 2)BAT25在作為微衛(wèi)星位點(diǎn)判斷腫瘤的微衛(wèi)星不穩(wěn)定時(shí)應(yīng)同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 結(jié)論 癌癥基因組再測序技術(shù)能夠發(fā)現(xiàn)并篩查出更多與癌癥疾病相關(guān)的基因突變。我們應(yīng)用基因序列再測序技

8、術(shù)對(duì)CDH1基因在散發(fā)性胃癌和家族性胃癌成員中的變異進(jìn)行篩查，共檢測出19處CDH1基因變異，其中發(fā)現(xiàn)9個(gè)新的突變位點(diǎn)。-1030位點(diǎn)的A基因型和-284位點(diǎn)的A基因型趨向于胃癌的低分化。家族性胃癌成員比散發(fā)性胃癌具有更多的突變位點(diǎn)。CDH1基因多處變異的生物學(xué)意義有待進(jìn)一步研究。 miRNAs與腫瘤的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)。在腫瘤研究中，miRNAs的研究應(yīng)首先著眼于在腫瘤乖正常組織中表達(dá)有差異的miRNAs。本研究采用石蠟包埋

9、組織進(jìn)行miRNAs表達(dá)研究，證明miRNAs在胃癌發(fā)生中起著重要的作用，發(fā)現(xiàn)胃癌與miR-2l和miR-155的過表達(dá)相關(guān)，部分胃癌與miR-145的低表達(dá)相關(guān)。福爾馬林固定、石蠟包埋的標(biāo)本可以用來較好地進(jìn)行大規(guī)?；仡櫺匝芯恐衜iRNAs的表達(dá)研究。 多重?zé)晒釶CR方法可以很好地用來檢測胃癌的微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)，較傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳更方便、精確。漢族散發(fā)性胃癌的MSI與性別、腫瘤分化程度、組織學(xué)分類、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及