腫瘤細胞膜上核苷載體的熒光標記、分析及實用性研究.pdf

1、本論文利用熒光分析法對細胞膜上的核苷載體進行了標記與定量分析研究,主要內(nèi)容包括:提出用潘生丁作為熒光標記物測定細胞膜上的核苷載體的新方法.實驗考察了潘生丁的熒光光譜特性,探討了溶液pH值、溫度、放置時間等因素對潘生丁熒光強度的影響,優(yōu)化了潘生丁測定的實驗條件.在優(yōu)化實驗條件下,潘生丁的濃度與其熒光強度在1.0×10<'-12>到1.0×10<'-9>M之間呈線性,線性方程為F=1.37+17.3×C,相關(guān)系數(shù)為0.997,方法的最低檢出

2、限為2.8×10<'-13>M,樣品在濃度為1.0×10<'-12>-1.0×10<'-9> M之間測定的平均相對標準偏差為2.7％(n=9).潘生丁與胰腺腫瘤細胞孵育30分鐘后,測得細胞膜樣品溶液中潘生丁的濃度為2.9(±.24)×10<'-11>M,單個細胞表面上與潘生丁結(jié)合的核苷載體的數(shù)量為1.75(±0.14)×10<'5>個.與其它核苷載體的定量分析方法相比,本方法簡單方便,靈敏度高,不存在放射危害.潘生丁除了作為核苷載體EN

3、T的高效熒光標記物之外,它還是一種核苷載體ENT的阻斷劑.在標記核苷載體ENT的同時,還能發(fā)揮阻斷作用,阻止進入腫瘤細胞內(nèi)的核苷類抗腫瘤藥物順濃度梯度流出細胞外,并從而可望提高聯(lián)合化療的療效.具有其他核苷載體ENT阻斷劑所不可替代的優(yōu)點.為了考察潘生丁對阻斷核苷載體ENT的作用,建立了細胞內(nèi)核苷衍生物類藥物6-巰基嘌呤的測定方法.考察了6-巰基嘌呤的熒光光譜特性,研究了溶液pH值、溫度、放置時間等因素對6-巰基嘌呤熒光強度的影響,獲得6

4、-巰基嘌呤測定的優(yōu)化條件.6-巰基嘌呤的濃度與其熒光強度在4.0×10<'-11>到4.0×10<'-6>M之間呈線性,相關(guān)系數(shù)為0.9997,線性方程為F=95.8C+1.6,方法的最低檢出限為8.2×10<'-12> M,樣品在濃度為4.0×10<'-12>-4.0×10<'-6>M之間的相對標準偏差為4.3％(n=9).6-巰基嘌呤與胰腺腫瘤細胞孵育60分鐘后,計算出實驗樣品溶液中細胞內(nèi)6-巰基嘌呤的濃度為2.38±0.088 n

5、M.方法簡單方便,靈敏度和精密度高.可作為臨床細胞內(nèi)6-巰基嘌呤測定的一種參照方法.本研究考察了作為核苷載體阻斷劑的潘生丁對細胞膜上核苷載體轉(zhuǎn)運6-巰基嘌呤的影響.胰腺腫瘤細胞在體外與潘生丁孵育時,孵育初期細胞膜上潘生丁的濃度迅速提高,30分鐘后達到結(jié)合平衡.固定孵育時間30分鐘,細胞膜上潘生丁的濃度隨細胞外潘生丁濃度的增加而增加,細胞外潘生丁濃度達200 μM后趨于結(jié)合平衡并由此測算出20℃時潘生丁在胰腺腫瘤細胞膜上的結(jié)合常數(shù)為4.7

6、(±0.53)×10<'10>M<'-1>.未加潘生丁的6-巰基嘌呤在與胰腺腫瘤細胞孵育60分鐘,細胞外6-巰基嘌呤的濃度在60 μM時細胞內(nèi)6-巰基嘌呤的濃度達到飽和.加入潘生丁后觀察到細胞內(nèi)6-巰基嘌呤的濃度比未加前的濃度提高了0.49倍,前后實驗結(jié)果有統(tǒng)計學顯著性差異(p<0.05),實驗結(jié)果驗證了潘生丁對核苷載體阻斷的機制是對ENT的阻斷而非對CNT的阻斷.潘生丁通過對平衡型ENT的阻斷,防止了ENT把6-巰基嘌呤從細胞內(nèi)泵出;