亞急性1,2-DCE中毒性腦水腫實驗動物模型建立及其相關機制的研究.pdf

1、前言
　　二氯乙烷(Dichloroethane，DCE)系鹵代烴類化合物，為工業(yè)上常用的有機溶劑之一，主要用于粘合劑、溶劑和氯代烴的生產。DCE有二種異構體，其中1，2-DCE屬高毒類，職業(yè)中毒均為1，2-DCE引起。1990年以前，國內外有關1，2-DCE職業(yè)中毒的報道很少。但1990年以后，國內的多個省份陸續(xù)發(fā)生了多起嚴重的亞急性1,2-DCE職業(yè)中毒事故，其臨床表現以中毒性腦病為主，腦水腫為其主要的病理過程。目前，亞急性1

2、，2-DCE職業(yè)中毒已成為嚴重危害我國勞動者健康與生命的職業(yè)病之一。但有關1，2-DCE中毒性腦水腫機制的研究資料很少，亟待進行深入研究。
　　關于腦水腫的形成機制有眾多學說，傳統(tǒng)的腦水腫發(fā)生機制學說包括“血腦屏障損傷”、“能量代謝障礙”、“氧自由基損傷”、“鈣離子超載”及“神經遞質興奮性毒性損傷”等。其中，血腦屏障損傷和能量代謝障礙學說被認為是血管源性腦水腫和細胞毒性腦水腫發(fā)生的基礎。近年來，隨著人們對腦水腫機制研究的不斷深入，

3、基質金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)和水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)表達異常在血管源性和細胞毒性腦水腫形成和發(fā)展過程中的作用受到了廣泛的關注。
　　本研究以昆明種小鼠為研究對象，通過建立亞急性1，2-DCE中毒性腦水腫實驗動物模型，深入探討AQPs和MMPs表達、腦組織能量代謝及血腦屏障功能等在亞急性1，2-DCE中毒性腦水腫發(fā)生與發(fā)展過程中的改變，為揭示亞急性1，2-DCE中

4、毒性腦水腫的可能發(fā)生機制提供實驗參考數據。
　　方法
　　1、實驗動物分組與染毒
　　實驗一，腦水腫實驗動物模型的建立:選用雌性健康昆明種小鼠40只，隨機分為對照組及1.1、1.2和1.3mg/L1，2-DCE染毒組，每組10只小鼠。將實驗動物置于100L靜式染毒柜中，每天染毒3.5h。染毒結束后的次日觀察小鼠中毒癥狀和死亡情況，若某組小鼠的死亡達半數以上，則終止整個實驗，并處死各組剩余的存活小鼠。對照組小鼠除不暴露1

5、，2-DCE外，其余處理過程同染毒組小鼠。
　　實驗二，腦水腫發(fā)生機制的研究:選用雌性健康昆明種小鼠200只，隨機分為對照組及1.2mg/L1，2-DCE染毒1d、2d和3d組，每組50只小鼠。將小鼠置于100L靜式染毒柜中，染毒組小鼠以1.2mg/L1，2-DCE每天染毒3.5h。對照組小鼠除不暴露1，2-DCE外，其余處理過程同染毒組小鼠。
　　2、指標測定
　　染毒結束后，乙醚麻醉，斷頭處死小鼠，快速取腦組織進行

6、如下檢測。
　　2.1腦含水量測定
　　腦含水量(％)=（濕重-干重）/濕重×100％。
　　2.2腦組織病理學觀察
　　取一側腦組織，甲醛固定72h后，普通石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片，片厚5μm，常規(guī)HE染色，普通光鏡下觀察。
　　2.3腦組織中AQP4、MMP2和MMP9表達的測定
　　采用RealtimeRT-PCR、Western-blot和免疫熒光組織化學法分別檢測小鼠腦組織中AQP4、MMP2

7、和MMP9蛋白和mRNA的表達。
　　2.4腦組織能量代謝相關指標的測定
　　采用生化試劑盒法分別檢測小鼠腦組織中ATP和乳酸含量及Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活性。
　　2.5血腦屏障超微結構觀察
　　取另一側腦組織，低溫快速切取約1mm3腦皮質，用2.5％戊二醛磷酸鹽緩沖液4℃下固定24h，1％鋨酸固定2h，梯度酒精脫水，環(huán)氧樹脂浸透包埋，超薄切片機切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，采用透射電子顯微

8、鏡進行腦皮質中血腦屏障超微結構的觀察。
　　2.6腦組織中ZO-1和Occludin表達的測定
　　采用RealtimeRT-PCR、Western-blot和免疫熒光組織化學法檢測小鼠腦組織中ZO-1和Occludin蛋白和mRNA的表達。
　　3、統(tǒng)計分析
　　實驗數據采用SPSS16.0進行統(tǒng)計分析。多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用q檢驗(SNK)。以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計學

9、意義的判定標準。
　　結果
　　一、亞急性1，2-DCE中毒性腦水腫實驗動物模型的建立
　　1、各組小鼠1，2-DCE中毒的表現
　　染毒3天后，1.2和1.3mg/L染毒組的存活小鼠除出現程度不同的行動遲緩和軀體震顫外，在被抓尾提起時，小鼠表現有明顯的雙前肢交叉及雙后肢緊抱現象。除外，1.3mg/L染毒組共有6只小鼠死亡，1.2mg/L染毒組共有3只小鼠死亡。1.1mg/L染毒組無小鼠死亡，但1只小鼠有輕微中毒

10、表現。
　　2、1,2-DCE染毒對各組小鼠體重增長的影響
　　1.3mg/L染毒組小鼠的體重隨著實驗天數的增加呈下降趨勢。1.2mg/L染毒組小鼠的體重在染毒1d時上升，隨后也呈下降趨勢，對照組和1.1mg/L染毒組小鼠的體重均呈緩慢上升趨勢。
　　3、1，2-DCE染毒對各組小鼠腦含水量和腦臟器系數的影響
　　1.2和1.3mg/L染毒組小鼠的腦含水量和腦臟器系數均顯著高于對照組。但1.1mg/L染毒組小鼠的

11、腦含水量和腦臟器系數與對照組比較均未見顯著差異。
　　4、1，2-DCE染毒對小鼠腦組織結構影響的病理學觀察
　　對照組小鼠的腦組織結構清晰，未見異常改變。而1.2和1.3mg/L染毒組小鼠的腦組織中，細胞核周圍腔隙增寬，胞漿淡染，胞體腫脹變性，邊緣模糊;部分細胞及毛細血管周圍腔隙擴張等，呈現典型的腦水腫病理改變。1.1mg/L染毒組小鼠的腦組織結構中未見明顯腦水腫病理改變。
　　二、亞急性1，2-DCE中毒性腦水腫發(fā)

12、生機制的研究
　　1、1，2-DCE染毒對各組小鼠腦組織中AQP4、MMP2和MMP9表達的影響
　　染毒2d和3d組的小鼠腦組織中AQP4蛋白含量及MMP9mRNA含量顯著高于對照組，而染毒3d組的小鼠腦組織中MMP2和MMP9蛋白含量及AQP4mRNA含量也顯著高于對照組;但各染毒組小鼠的腦組織中MMP2mRNA含量與對照組小鼠比較未見明顯改變。染毒1d組的小鼠腦組織中AQP4、MMP2和MMP9表達與對照組比較均未見顯

13、著差異。
　　2、1,2-DCE染毒對小鼠腦組織中能量代謝的影響
　　染毒3d組的小鼠腦組織中ATP含量顯著低于對照組，而染毒3d組的小鼠腦組織中乳酸含量顯著高于對照組。
　　各染毒組小鼠的腦組織中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性與對照組相比均呈下降趨勢，其中染毒2d和3d組的小鼠腦組織中Ca2+-ATPase活性均顯著低于對照組。染毒3d組的小鼠腦組織中Na+-K+-ATPase活性也顯著低于對照組。<

14、br>　　3、1,2-DCE染毒對小鼠的血腦屏障超微結構的影響
　　對照組小鼠的腦組織毛細血管管腔形態(tài)規(guī)則、內皮細胞厚度適中，內皮細胞間的緊密連接結構清晰，基底膜厚薄均一，基底膜外有星形膠質細胞終足圍繞;染毒1d組的小鼠腦組織毛細血管內皮細胞厚薄不等，但緊密連接結構尚完整;染毒2d組的小鼠腦組織毛細血管管腔狹窄、閉塞，內皮細胞間緊密連接松散。染毒3d組的小鼠腦毛細血管內皮細胞間緊密連接出現大量溶解、脫落，基底膜片狀溶解、缺失，星形

15、膠質細胞終足極度水腫，呈現為大片電子空白區(qū)。
　　4、1，2-DCE染毒對小鼠腦組織中毛細血管內皮細胞間緊密連接蛋白的影響
　　各染毒組小鼠的腦組織中ZO-1和Occludin蛋白含量與對照組相比均呈下降趨勢，其中染毒2d和3d組的小鼠腦組織中ZO-1和Occludin蛋白含量顯著低于對照組小鼠。
　　各染毒組小鼠的腦組織中ZO-1和OccludinmRNA水平與對照組相比也呈下降趨勢，其中染毒2d和3d組的小鼠腦組織