黃芩苷抑制牙周炎牙槽骨吸收的作用及機理研究.pdf

1、牙周炎的破壞過程，是菌斑和宿主之間通過復雜的分子機制相互作用的結果。宿主的防御過程分為非特異性的炎癥反應和特異性的免疫應答反應（包括體液免疫、細胞免疫和補體系統(tǒng)）。牙周炎可以說是一種由細菌引起的免疫炎癥性疾病，它的發(fā)生、發(fā)展與免疫細胞及其相關因子的參與有關。
　　牙槽骨吸收是牙周炎的主要病理變化之一。在牙周炎的治療中，主要為控制或消除炎癥并促進組織再生。應用藥物控制炎癥、阻斷牙槽骨吸收和促進骨再生是不可缺少的一種治療方法。一些中草

2、藥的提取物或單體被證實具有抗炎和直接或間接的抑制破骨細胞分化和功能的作用。
　　黃芩苷(baicalin)是由唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensiGeorgi)的干燥根中提取的一種黃酮類化合物。黃芩苷是黃芩及其制劑的主要質(zhì)量控制指標成分。據(jù)藥理學研究報道,黃芩苷具有顯著的抗炎作用，可抑制促進破骨細胞活化和功能的各種因子的產(chǎn)生。一系列的研究提示黃芩苷在牙周病的防治方面具有一定的應用前景。但其在藥理作用的機理研究

3、方面尚有很多工作要做。
　　牙周炎時，T細胞數(shù)量、活性增高，導致炎癥細胞因子分泌增加，加重牙周炎癥和骨吸收。TGF-β可以抑制T細胞的活性和增殖。因而設想黃芩苷的抗炎抗骨吸收的作用可能通過TGF-β起作用，而巨噬細胞是分泌TGF-β的主要來源。故此，我們提出黃芩苷抑制牙周炎牙槽骨吸收的機理可能是：通過促進巨噬細胞分泌TGF-β，從而抑制T細胞的活性、增殖和數(shù)量，導致T細胞產(chǎn)生的TNF等炎性因子減少，進一步引起RANKL誘導的破骨細

4、胞形成減少，從而使牙槽骨喪失減緩或停止，牙周炎癥減輕。
　　本實驗的目的：①通過動物實驗，從Micro-CT和組織學的角度研究黃芩苷對實驗性牙周炎牙槽骨吸收的影響；②研究黃芩苷對巨噬細胞分泌TGF-β1的影響；③利用基因干涉技術，將TGF-β基因沉默。研究當TGF-β基因沉默后，黃芩苷是否能夠使牙周膜成纖維細胞分泌RANKL/OPG的比值降低。從而證實黃芩苷是否通過TGF-β抑制T細胞的活性、增殖和數(shù)量，導致T細胞產(chǎn)生的TNF等炎

5、性因子減少，進一步使牙周膜成纖維細胞分泌RANKL/OPG的比值降低。初步揭示黃芩苷的作用機理，為將黃芩苷應用于牙周病的防治提供理論和實驗依據(jù)。
　　一．黃芩苷對實驗性牙周炎牙槽骨吸收的影響
　　建立大鼠牙周炎模型，局部注射黃芩苷，利用micro-CT和組織學檢查觀察黃芩苷對實驗性牙周炎牙槽骨吸收的影響。micro-CT構建出大鼠牙槽骨結構的計算機三維圖像數(shù)據(jù)集，得到良好的視覺效果的同時測定骨小梁的三維結構參數(shù)，從而獲得黃芩

6、苷抑制大鼠牙周炎牙槽骨吸收的更為直觀和確切的證據(jù)。結果證實黃芩苷可以有效的抑制LPS誘導的大鼠牙周炎牙槽骨的吸收，1.0μｇ/ｍｌ的黃芩苷較之0.1μｇ/ｍｌ的黃芩苷具有更好的效果。
　　二.黃芩苷對巨噬細胞分泌TGF-β1的影響
　　體外分離培養(yǎng)人巨噬細胞,將不同濃度的黃芩苷加入培養(yǎng)液，48h后用RT-PCR、Westernblot技術檢測各組細胞TGFβ1表達情況。發(fā)現(xiàn)巨噬細胞在不同濃度黃芩苷的作用下,TGFβ1mRNA

7、的表達和蛋白表達均隨黃芩苷濃度的增加而增加(P<0.05)。其中,1.0μｇ/ｍｌ濃度黃芩苷作用最為顯著。本實驗證實了黃芩苷可以促進巨噬細胞產(chǎn)生TGFβ1。
　　三.TGF-βⅡR特異性siRNA表達載體的構建及鑒定
　　根據(jù)GeneBank中報道的TGFβⅡR核苷酸序列，參考siRNA的設計原則，按照pSilencer3.1H1載體的設計要求，設計2條siRNA序列。合成的單鏈寡核苷酸鏈經(jīng)退火、磷酸化后形成雙鏈DNA，定向

8、插入pSilencer3.1H1載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞增菌后提取質(zhì)粒。DNA測序證實該重組質(zhì)粒序列與所設計序列完全一致，表明針對TGF-βⅡR基因的siRNA表達載體已構建成功。為下一步研究工作的開展奠定了良好基礎。
　　四.siRNA轉(zhuǎn)染T細胞并鑒定
　　用成功構建的2種針對HBV基因的siRNA表達載體pSilencer3.1H1-TGF-βⅡR（1-2）轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達TGF-βⅡR的T細胞，經(jīng)潮霉素篩選獲得穩(wěn)定的單克隆細胞

9、株。篩選出的單克隆細胞的流式細胞分析結果和細胞生長曲線顯示，細胞周期、增殖指數(shù)以及細胞生長速度與對照無顯著差異，提示導入TGF-βⅡR特異性siRNA表達載體對T細胞的生長無明顯影響。RT-PCR結果證實siRNA能降低TGF-βⅡRmRNA的表達。Westernblot結果證實siRNA能抑制T細胞內(nèi)TGF-βⅡR蛋白的合成。
　　五.黃芩苷對牙周膜細胞OPG-RANKL表達的影響
　　將正常牙周膜成纖維細胞與轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染

10、siRNA的T細胞置于加有內(nèi)毒素和黃芩苷的培養(yǎng)液中，分為6組，觀察黃芩苷對正常牙周膜成纖維細胞上OPG-RANKL表達的影響。研究結果證實黃芩苷可以降低PDLC表面RANKL/OPG比值，同時表明TGF-β的信號傳導在黃芩苷影響PDLC表面的RANKL/OPG比值的過程中起到重要的作用。分析認為黃芩苷可能通過增強TGF-β對T細胞的抑制作用，引起T細胞活性降低、數(shù)量減少，導致T細胞在內(nèi)毒素作用下分泌的TNF-α等炎癥因子減少，降低RAN

11、KL/OPG比值，進而降低破骨細胞形成，減少骨丟失，降低牙周炎進展的危險因素。本研究還發(fā)現(xiàn)黃芩苷除了通過TGFβ途徑外，還可能有其他的通路對PDLC表面的RANKL/OPG進行調(diào)控。
　　結論：黃芩苷可以有效的抑制牙周炎牙槽骨的吸收。其作用機制可能為：黃芩苷促進巨噬細胞分泌TGF-β，從而抑制T細胞的活性、增殖和數(shù)量，導致T細胞產(chǎn)生的TNF等炎性因子減少，進一步引起RANKL誘導的破骨細胞形成減少，從而使牙槽骨喪失減緩或停止，牙周