水飛薊賓納米晶釋藥系統(tǒng)的構(gòu)建與評價(jià).pdf

1、難溶性化合物的制劑研究是新藥研發(fā)的重要難題，是導(dǎo)致研發(fā)高失敗率、高風(fēng)險(xiǎn)和高投入的關(guān)鍵原因，也是降低藥物臨床療效、增加臨床不良反應(yīng)發(fā)生率、加重醫(yī)療費(fèi)用的重要因素。納米晶是近十幾年興起并逐步應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的藥物制劑新技術(shù)，具有小尺寸效應(yīng)和量子隧道效應(yīng)，其首要特征是提高難溶性藥物的溶解度和溶出速率，以及由此派生出的其它諸多理化性質(zhì)和生理特性。水飛薊賓是一種具有低毒高效保肝特性的難溶性黃酮木脂素類化合物，是水飛薊的主要活性成分?，F(xiàn)上市劑型為片

2、劑和膠囊劑，Beagle犬口服生物利用度約為17％，因其水溶性差而導(dǎo)致低生物利用度嚴(yán)重影響了臨床療效。本論文將以納米晶為改善難溶性藥物功效的關(guān)鍵技術(shù)、以水飛薊賓為模型藥物，進(jìn)行其納米晶釋藥系統(tǒng)的構(gòu)建與評價(jià)。
　　 本課題主要目的是通過活塞.縫隙式高壓均質(zhì)法構(gòu)建可供口服和注射給藥的兩種水飛薊賓納米晶制劑，建立水飛薊賓體內(nèi)外分析方法，考察其藥劑學(xué)特性和體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)及組織分布特征，研究其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)特性，并通過體內(nèi)外急性肝損傷模型評價(jià)水

3、飛薊賓納米晶的藥效學(xué)特征。
　　 本研究的主要內(nèi)容包括處方前研究、納米晶工藝篩選與處方研究、冷凍干燥工藝研究與保護(hù)劑篩選、HPLC-MS建立生物樣品分析方法、Beagle犬口服和靜脈滴注納米晶藥動(dòng)學(xué)研究、小鼠尾靜脈注射納米晶組織分布研究、體外Caco-2細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)研究、體外HL7702肝細(xì)胞和體內(nèi)Beagle犬急性肝損傷模型藥效學(xué)研究等。
　　 采用HPLC-DAD建立了體外樣品中水飛薊賓的分析方法，方法學(xué)考察符合要求

4、。處方前研究結(jié)果表明，水飛薊賓的溶解度隨溶劑的pH值的遞增而增大，pH7.4的PBS中的溶解度為49.7μg·ml-1，正辛醇-水中油水分配系數(shù)1gP約為2.8(1gP<5)，提示水飛薊賓低溶解度所導(dǎo)致的較慢的溶出速率可能是致使水飛薊賓口服生物利用度低的主要原因。
　　 制備工藝與處方篩選結(jié)果表明，活塞-縫隙式高壓均質(zhì)法制備水飛薊賓納米晶具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，適合其納米晶的制備，納米晶粒徑隨均質(zhì)壓力的增大而逐步減小，其180

5、0 bar時(shí)粒徑約為800 bar時(shí)的1/5；隨均質(zhì)次數(shù)的增多，納米晶粒度分布逐步趨于均一，且以最終壓力下均質(zhì)15次為佳。采用L9(34)正交設(shè)計(jì)法進(jìn)行納米晶處方篩選，以不同濃度的磷脂、泊洛沙姆F68、SDS和PVPK30為篩選對象，以Zeta-電位為考察指標(biāo)，分析結(jié)果表明以0.2％磷脂，0.1％泊洛沙姆F68，0.05％SDS，0.05％PVP K30為處方時(shí)納米晶的Zeta-電位最大，經(jīng)其安全性和穩(wěn)定性因素考慮，最終確定處方組成為：

6、每100 ml注射用水中含0.5g水飛薊賓、0.2 g磷脂和0.1 g泊洛沙姆F68。
　　 為進(jìn)一步提高水飛薊賓納米晶的穩(wěn)定性，對包括甘露醇、海藻糖、β-環(huán)糊精、乳糖、葡萄糖及右旋糖酐等在內(nèi)的多種多元醇和高分子化合物進(jìn)行真空冷凍干燥保護(hù)劑篩選，以凍干品外觀形態(tài)、納米晶與保護(hù)劑結(jié)合形式等為考察因素，并最終確定5％(w/v)甘露醇為最佳保護(hù)劑，凍干品外觀為完整的圓餅狀，表面平滑，質(zhì)地輕柔，顯微觀察表明在凍干過程中甘露醇充分的代替了

7、水-OH作用，與納米晶交替形成有序網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，阻止了納米晶的相互接觸和熟化，并起到支架劑作用；凍干工藝考察表明，以-80℃預(yù)凍24h、真空凍干48 h為宜，凍干品含水量低于3％。
　　 為考察水飛薊賓納米晶口服和注射給藥的可行性，制備粒徑不同大小的納米晶SN-A和SN-B：800 bar下均質(zhì)15次并按照凍干工藝干燥，得納米晶SN-A；1800bar下均質(zhì)15次并按照凍干工藝干燥，得納米晶SN-B；并分別對SN-A和SN-B進(jìn)行物

8、相分析和表征。SN-A的粒徑及Zeta-電位分別為641.8±14.7 nm(PI～0.375)和-23.1±0.6 mV，SN-B的粒徑及Zeta-電位分別為127±1.9 nm(PI～0.292)和-25.5±0.7 mV；TEM觀察表明SN-A和SN-B中納米晶基本呈完整球形外觀，粒徑與激光粒度分布儀所測結(jié)果基本相符，且粒度分布較為均一；AFM掃描表明SN-A與SN-B的形態(tài)間存在一定差異，且可見穩(wěn)定劑在納米晶表面形成的保護(hù)膜；凍

9、干品SEM觀察顯示，納米晶粒度分布均勻，SN-B的粒徑小于SN-A，兩者外觀均呈不規(guī)則的顆粒狀；DSC法和XRPD法分析納米晶中水飛薊賓晶型，結(jié)果表明，高壓均質(zhì)過程和冷凍干燥操作未引起水飛薊賓晶態(tài)的轉(zhuǎn)化；pH6.0和pH7.4的PBS中的納米晶溶出速率考察表明，納米晶可提高水飛薊賓溶出速率，且SN-B溶出速率大于SN-A；pH6.0的PBS中，納米晶可將水飛薊賓的飽和溶解度提高約2.2倍；SN-A和SN-B的比表面積分別為0.435 m

10、2·g-1和0.484 m2·g-1，SN-A孔隙率為0.00401ml·g-1孔徑為17.05±16.0 nm，SN-B孔隙率為0.00431 ml·g-1，孔徑為17.03±16.4nm；穩(wěn)定性加速實(shí)驗(yàn)考察表明SN-A和SN-B在6個(gè)月內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。
　　 采用HPLC-MS建立了犬血漿等生物樣品中水飛薊賓含量檢測的分析方法，方法學(xué)考察符合《化學(xué)藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》要求。Beagle犬口服給藥水飛薊賓

11、原料藥或納米晶(SN-A，SN-B)20 mg·kg-1后經(jīng)DAS2.0藥動(dòng)學(xué)程序計(jì)算，均符合二室模型。納米晶SN-A和SN-B生物利用度分別為原料藥組的2.3倍和2.9倍；SN-A和SN-B的Cmax高于原料藥組；原料藥組的MRT值最小，SN-A的較長，而SN-B的為最長；原料藥組、SN-A和SN-B的tmax值分別為0.56 h、1.03 h和1.08 h。Beagle犬靜脈滴注給藥水飛薊賓溶液或納米晶(SN-A，SN-B)15 m

12、g·kg-1后經(jīng)DAS2.0藥動(dòng)學(xué)程序計(jì)算，溶液組和SN-B組符合三室模型，SN-A組符合二室模型。與溶液組相比，納米晶可延長t1/2并增大AUC，盡管溶液組Cmax最高，但清除率高，其MRT較短。該實(shí)驗(yàn)表明，對于低溶出速率和體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)欠佳的水難溶性藥物-水飛薊賓，采用納米晶技術(shù)可改善其藥動(dòng)學(xué)特征。
　　 為考察納米晶體內(nèi)分布特征和粒徑對其分布的影響，進(jìn)行小鼠以20 mg·kg-1劑量分別尾靜脈注射水飛薊賓溶液、SN-A和S

13、N-B后的組織分布研究。靶向指數(shù)、選擇性指數(shù)、靶向效率和相對靶向效率評價(jià)指標(biāo)均證實(shí)水飛薊賓納米晶具有肝臟被動(dòng)靶向性；從藥物濃度角度考察，納米晶可降低血漿和心臟中水飛薊賓濃度，增加肝臟中的濃度；從靶器官藥量角度考察，溶液組在肝臟的分布比例介于15％～35％之間，SN-A和SN-B分布比例分別介于46％～63％和31％～67％之間，且在給藥后10 h內(nèi)SN-A在肝臟的分布比例穩(wěn)定在40％～50％之間，提示納米晶SN-A小鼠尾靜脈注射肝臟靶向

14、性優(yōu)于納米晶SN-B。
　　 為考察納米晶對水飛薊賓口服吸收的影響，進(jìn)行水飛薊賓納米晶SN-A和SN-B在Caco-2細(xì)胞中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)研究，結(jié)果表明，當(dāng)納米晶中水飛薊賓濃度低于125μg·ml-1時(shí)無細(xì)胞毒性，且藥物不影響Caco-2細(xì)胞活性與增殖。在pH6.0和pH7.4的Hanks’緩沖液中，以水飛薊賓原料藥和物理混合物為參比對象，在pH6.0環(huán)境下，SN-A、SN-B和原料藥的Papp分別為5.17±0.77×10-7cm

15、·s-1、6.43±0.41×10-7cm·s-1和2.47±0.4×10-7cm·s-1；在pH7.4環(huán)境下，SN-A、SN-B和原料藥的Papp分別為5.73±0.75×10-7 cm·s-1、1.02±0.17×10-6 cm·s-1和2.70±0.44×10-7cm·s-1。SN-A和SN-B均能提高水飛薊賓表觀滲透系數(shù)，提高藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)速率，且SN-B的表觀滲透系數(shù)大于SN-A。
　　 為進(jìn)行納米晶體外藥效學(xué)考察，以濃

16、度為5 mM的H2O2與HL7702細(xì)胞孵育24 h，建立體外肝細(xì)胞化學(xué)性損傷模型；HL7702肝細(xì)胞損傷模型預(yù)防性給藥時(shí)，水飛薊賓溶液組保護(hù)作用呈濃度依賴性，且在10μg·ml-1時(shí)保護(hù)作用最強(qiáng)，SN-A在50μg·ml-1時(shí)最強(qiáng)，并且SN-A的保護(hù)效應(yīng)強(qiáng)于溶液組；HL7702肝細(xì)胞損傷模型治療性給藥時(shí)，溶液組和SN-A的保護(hù)作用未及預(yù)防性給藥時(shí)明顯。HL7702肝細(xì)胞HE染色證實(shí)，以10μg·ml-1預(yù)防性給藥時(shí)，SN-A組細(xì)胞數(shù)目

17、較多，分布規(guī)則，胞漿豐滿，細(xì)胞核形態(tài)及核質(zhì)比接近于正常細(xì)胞；溶液組細(xì)胞狀況介于模型組和SN-A組之間，個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)碎核。因此，水飛薊賓可預(yù)防性保護(hù)肝細(xì)胞免受H2O2的損傷，且SN-A的保護(hù)效果優(yōu)于溶液組。
　　 為進(jìn)行納米晶體內(nèi)藥效學(xué)考察，以CCl4的花生油溶液(1:1，w/w)按照1 ml·kg-1劑量皮下多點(diǎn)注射建立Beagle犬急性肝損傷模型，SN-A滴注給藥15 mg·kg-1、SN-B灌胃給藥20 mg·kg-1，復(fù)方

18、甘草酸單銨為陽性對照，并設(shè)模型組和水飛薊賓溶液對照組，檢測AST、ALT、TBIL等肝功指標(biāo)，測定肝臟SOD和MDA活性，病理切片檢查肝組織病理改變，考察水飛薊賓納米晶口服和靜脈給藥的安全性和有效性。經(jīng)肝功能檢測和肝病理切片觀察證實(shí)，本文成功建立了CCl4致Beagle犬急性肝損傷模型。與水飛薊賓溶液組相比，納米晶可更有效的將偏離正常值的AST、ALT、ALP、TBIL、GGT等向正常值調(diào)整回歸，并增加肝組織中SOD活性，降低MDA產(chǎn)生

19、量，減少肝細(xì)胞氣球樣變和炎性細(xì)胞浸潤，避免大面積壞死，保護(hù)肝細(xì)胞核膜完整性，穩(wěn)定肝細(xì)胞。因此，水飛薊賓納米晶SN-B口服給藥和SN-A靜脈注射給藥可有效預(yù)防CCl4引起的Beagle犬急性肝損傷，且不會(huì)產(chǎn)生藥源性肝損傷，進(jìn)一步證實(shí)納米晶可顯著提高水飛薊賓口服生物利用度和靜脈給藥靶向性，提高水飛薊賓的保肝藥效作用。
　　 本文成功構(gòu)建了供注射和口服給藥的水飛薊賓納米晶釋藥系統(tǒng)，并進(jìn)行了體內(nèi)外評價(jià)。應(yīng)用活塞-縫隙式高壓均質(zhì)法制備了供

20、口服和靜脈給藥的水飛薊賓納米晶，并以甘露醇為保護(hù)劑進(jìn)行冷凍干燥提高其穩(wěn)定性，水飛薊賓晶型保持不變，粒度分布均勻，溶解度和溶出速率增加，具備良好的制劑學(xué)特性。納米晶可提高水飛薊賓的口服生物利用度，增加Caco-2細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)；延長靜脈滴注給藥時(shí)水飛薊賓半衰期，并增加肝臟靶向效率。納米晶可增強(qiáng)水飛薊賓口服和靜脈給藥時(shí)對Beagle犬急性肝損傷的保護(hù)作用。因此，本文研究表明，納米晶可提高水飛薊賓口服生物利用度和并實(shí)現(xiàn)靜脈被動(dòng)肝臟靶向傳輸給