HSP70-HSP70-PC在舌癌熱療聯(lián)合CTL免疫療法中作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的： 舌癌及頰黏膜癌是常見(jiàn)的口腔鱗癌，目前口腔鱗癌的治療一般以手術(shù)切除為主，加以化療及放療方案，平均5年生存率在50-60％左右，其晚期5年生存率尚不到30％。因此，尋找既能提高療效，又能避免毀容和破壞口頜系統(tǒng)功能的新治療方法，成為口腔鱗癌治療的一個(gè)方向；研究證實(shí)熱療過(guò)程中加熱誘發(fā)熱休克蛋白(HSPs)表達(dá)與熱耐受密切相關(guān)，因此，一次加熱后只能待HSPs表達(dá)減退熱耐受消失后才能行第二次加熱，這樣在腫瘤的熱療中就形成了治療盲區(qū)，

2、如何克服與HSPs高表達(dá)密切相關(guān)的熱耐受成為提高熱療療效的關(guān)鍵。 腫瘤免疫以細(xì)胞免疫為主，細(xì)胞免疫學(xué)研究主要目的之一是尋求腫瘤特異性抗原，活化殺傷腫瘤細(xì)胞的特異性T淋巴細(xì)胞(CTL)，增加機(jī)體對(duì)腫瘤排斥反應(yīng)；HSP70可以通過(guò)MHC-I類APC途徑遞呈抗原，刺激抗原特異性CD8<'+>T細(xì)胞免疫反應(yīng)。腫瘤細(xì)胞死亡過(guò)程中誘導(dǎo)HSP70高表達(dá)或從腫瘤細(xì)胞分離的HSP70能夠活化CTL引發(fā)機(jī)體抗瘤免疫反應(yīng)，HSP70在細(xì)胞膜表達(dá)參與了

3、內(nèi)源性腫瘤抗原肽與HSP70結(jié)合形成“分子伴侶”，通過(guò)APC表面的HSP70受體介導(dǎo)，在抗原呈遞過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。 基于以上認(rèn)識(shí)，從過(guò)去為降低熱耐受而想方設(shè)法降低HSP70表達(dá)，轉(zhuǎn)變?yōu)槔脽岑熀驣ISP70表達(dá)的高峰期施以I-ISP70-PC為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的免疫療法，把腫瘤熱療和免疫療法有機(jī)結(jié)合起來(lái)，揚(yáng)長(zhǎng)避短，既避免了熱療中形成的熱療耐受所導(dǎo)致的治療“盲區(qū)”，又克服了免疫治療中HSP70表達(dá)率低的缺點(diǎn)。本課題以此思路為立題依據(jù)，

4、探索一條口腔癌治療的新策略，即熱療聯(lián)合HSP70／HSP70-PC誘導(dǎo)的CTL免疫療法治療口腔癌。 方法： 本研究采用流式細(xì)胞技術(shù)和免疫組化方法研究舌癌Tea8113細(xì)胞熱休克后HSP70的表達(dá)，選取43℃加熱30min條件，通過(guò)檢測(cè)人舌癌Tca8113細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜HSP70的動(dòng)態(tài)表達(dá)，確定HSP70表達(dá)的峰值時(shí)間：然后在熱休克誘導(dǎo)HSP70高表達(dá)峰值時(shí)段，用親和層析方法提純HSP70多肽并用Western blot

5、鑒定；將提純的HSP70多肽體外刺激人脾淋巴細(xì)胞擴(kuò)增、活化，然后用MTT法測(cè)定其對(duì)舌癌Tea8113細(xì)胞的殺傷作用，并用電鏡觀察其培養(yǎng)上清誘導(dǎo)舌癌Tea8113細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；進(jìn)而在舌癌裸鼠移植瘤模型上，采用熱療聯(lián)合致敏CTL瘤周注射，觀察對(duì)裸鼠Tca8 113移植瘤的抑瘤效果。 結(jié)果： 1、43℃加熱30min后恢復(fù)12h組Tea8113細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜表達(dá)均較強(qiáng)，細(xì)胞膜上有較高的HSP70表達(dá)且具有可誘導(dǎo)性，再次加

6、熱后12h組細(xì)胞活性最高； 2、1g濕重的腫瘤細(xì)胞可提取純化HSP70蛋白85μg，通過(guò)SDS-PAGE和Western blot證實(shí)為HSP抗原肽復(fù)合物； 3、人舌鱗癌Tea8113細(xì)胞HSP70-PC與體外免疫擴(kuò)增的人脾淋巴細(xì)胞與Tca8113細(xì)胞當(dāng)效靶比為100：1和50：1時(shí)，致敏CTL的殺傷率分別為(77.4±2.9)％和(78.9±1.9)％，兩組間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。HSP70誘導(dǎo)的CTL對(duì)Tc

7、a8113的殺傷率與非抗原刺激的淋巴細(xì)胞比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P<0.01)，其培養(yǎng)上清能誘導(dǎo)舌癌Tca8113細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)變化； 4、熱療HT+CTL+IL-2組和CTL+IL-2+HT組抑瘤率分別為68.85％，61.8％，兩組HsP70表達(dá)OD值和腫瘤細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較均有顯著性差異(P<0.01)。 結(jié)論： 1、HSP70的迅速表達(dá)與緩慢降解對(duì)維持Tea8113細(xì)胞的生理功能有重要作用，