APA微囊化轉(zhuǎn)前腦啡肽原基因細(xì)胞移植鎮(zhèn)痛的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、慢性疼痛基因治療的靶組織主要集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)雖為“免疫特惠”區(qū)域，但異體細(xì)胞移植仍然存在一定的免疫排斥反應(yīng)，從而影響移植細(xì)胞的存活時(shí)間?；蚬こ碳?xì)胞移植鎮(zhèn)痛，還存在致瘤性問題。而微囊技術(shù)則為這一難題提供了可行的解決方案。采用微囊技術(shù)包裹細(xì)胞后，由于微囊包膜的免疫隔離作用，避免了細(xì)胞遭到受者免疫系統(tǒng)的直接攻擊，延長其在機(jī)體內(nèi)的生存時(shí)限。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)載PENK基因至靶細(xì)胞中，并且使用微囊包裹后進(jìn)行細(xì)胞移植，是否能夠起到鎮(zhèn)

2、痛作用，國內(nèi)外均未見報(bào)道。 本研究分別以鼠和人前腦啡肽原基因?yàn)槟康幕?，設(shè)計(jì)引物，內(nèi)側(cè)引物加上兩個(gè)酶切位點(diǎn)，分別同逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX2及質(zhì)粒載體pCDNA3.1(+)多克隆位點(diǎn)相一致，并成功構(gòu)建了pLNCX2一rPENK載體、pLNCX2一hPENK載體和pCDNA3.1(+)一hPENK載體；將pLNCX2一rPENK載體轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞PT67，收集病毒上清轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，分別從RNA水平及蛋白表達(dá)水平檢測PEN

3、K基因的表達(dá)，驗(yàn)證腦啡肽分泌量是否可以滿足動(dòng)物實(shí)驗(yàn)鎮(zhèn)痛需要，為進(jìn)一步微囊包裹及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)；本研究還將獲得的穩(wěn)定表達(dá)前腦啡肽原基因的細(xì)胞，直接或采用海藻酸鈉一多聚賴氨酸一海藻酸鈉(APA)微囊化包裹植入大鼠脊髓蛛網(wǎng)膜下腔，該方法避免轉(zhuǎn)基因細(xì)胞造成的潛在致癌性及機(jī)體的免疫反應(yīng)，比較兩種細(xì)胞移植方法所引起的鎮(zhèn)痛行為學(xué)變化；了解APA微囊化轉(zhuǎn)前腦啡肽原基因細(xì)胞植入對慢性疼痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)和可能機(jī)制；進(jìn)一步了解APA微囊的免疫隔離效果，為AP

4、A微囊化細(xì)胞脊髓蛛網(wǎng)膜下腔移植鎮(zhèn)痛技術(shù)提供更加充足的實(shí)驗(yàn)資料。 結(jié)論: 1．以大鼠及人前腦啡肽原基因?yàn)槟康幕颍晒?gòu)建了大鼠及人前腦啡肽原基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。 2．提取NIH3T3陽性克隆細(xì)胞的基因組DNA，PCR擴(kuò)增出逆病毒載體neor基因片段；通過RT-PCR、原位雜交和放射免疫檢測，從RNA水平及蛋白水平均證實(shí)大鼠PENK基因的表達(dá)。表明大鼠PENK基因可以整合到NIH3T3細(xì)胞染色體中，并能長期穩(wěn)定表達(dá)