皮下預(yù)血管化對共微囊法異種胰島移植影響的實驗研究.pdf

1、第一部分大鼠胰島的分離、純化、功能鑒定和微膠囊化 目的：1，探討大鼠胰島分離和純化的方法及烏司他丁對提高大鼠胰島收獲量的作用；2，研究大鼠胰島的功能鑒定方法；3，制備海藻酸鈉微膠囊大鼠胰島。 方法：1，隨機選取20只SD雄性大鼠，按不同的胰島分離，消化或純化方法分為4組，每組5只。①A組：膽總管灌注膠原酶V+Ficoll純化：②B組：膽總管灌注膠原酶V+手工純化；③C組：膽總管灌注膠原酶V+烏司他丁5000U/L+Fic

2、oll純化；④D組：膽總管灌注膠原酶V+烏司他丁5000U/L+手工純化；2，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測試法行大鼠胰島素釋放試驗；3，高壓靜電場微膠囊成型裝置制備海藻酸鈉微膠囊大鼠胰島。 結(jié)果：1，A組和B組獲得的胰島大部分外膜較完整，部分邊界不清；烏司他丁組(C組和D組)獲得的胰島外膜完整，邊界平滑，結(jié)構(gòu)致密。Ficoll純化法(A組和C組)獲得的胰島細胞團較小、胰島數(shù)量較少。而光鏡下移液吸移管手工挑揀純化法(B組和D組)純化的胰島不

3、但外膜完整，邊界平滑，結(jié)構(gòu)致密，胰島收獲量多，而且含有較多較大的胰島細胞團，胰島純度各組間無顯著差異；2，大鼠胰島素釋放試驗提示過夜培養(yǎng)的微膠囊胰島功能優(yōu)于裸露(無微膠囊)胰島；3，高壓靜電場微膠囊成型裝置制備的海藻酸鈉微膠囊胰島形態(tài)呈圓球形，直徑約400μm，囊壁光滑，大小均勻，無拖尾現(xiàn)象。 結(jié)論：1，消化過程中加入烏司他丁可提高胰島的質(zhì)量和數(shù)量，收獲的胰島數(shù)量多，外膜完整，邊界平滑，結(jié)構(gòu)致密。手工挑揀純化法可提高胰島收獲量，

4、但較費力和耗時；2，微膠囊對大鼠胰島具有保護作用；3，高壓靜電場微膠囊成型裝置制備的海藻酸鈉微膠囊胰島明顯優(yōu)于其他傳統(tǒng)成囊方法。 第二部分新型緩釋bFGF微囊的制備和小鼠皮下預(yù)血管化研究 目的：1，對海藻酸鈣凝膠珠體系進行改進，構(gòu)建新型bFGF緩釋微囊；2，研究新型緩釋bFGF微囊對受體小鼠皮下血管新生的作用。 方法：1，應(yīng)用高壓靜電場微膠囊成型裝置在海藻酸鈣凝膠珠形成過程中引入明膠，構(gòu)建新型bFGF緩釋微囊；2

5、，選取C57BL/6雄性小鼠12只，隨機分為4組，每組3只。①A組：小鼠背部皮下注射3μg新型bFGF微囊；②B組：小鼠背部皮下3μg bFGF一次性注射；③C組：空囊組；D組：小鼠背部皮下注射0.5ml生理鹽水。 結(jié)果：1，新型緩釋bFGF微囊形態(tài)呈圓球形，直徑約100μm，囊壁光滑，大小均勻，無拖尾；2，各組間新生血管數(shù)有非常顯著差異(F=55.20，P<0.01)，A組與其他各組相比較均有非常顯著差異(P<0.01)，B組

6、與C組和D組相比較有顯著差異(P<0.05)。 結(jié)論：1，在鈣離子存在的條件下，明膠與海藻酸鈉交聯(lián)形成凝膠，增強了海藻酸鈣緩釋效果，并通過靜電聚合進一步加強海藻酸鈣微囊的緩釋效果；2，新型自制緩釋bFGF微囊能明顯促進新生血管的形成，效果優(yōu)于相同劑量bFGF皮下注射，為微膠囊胰島皮下移植創(chuàng)造了必要條件。 第三部分受體皮下預(yù)血管化對微膠囊大鼠胰島移植治療糖尿病小鼠的影響 目的：研究新型bFGF微囊皮下預(yù)血管化微膠囊

7、SD大鼠胰島皮下移植治療化學性糖尿病小鼠的效果。 方法：1，C57BL/6雄性小鼠，bFGF微囊小鼠背部皮下注射兩周后，腹腔注射鏈脲霉素建立皮下預(yù)血管化化學性糖尿病小鼠模型，選取15只，隨機分為3組，每組5只，行微膠囊大鼠胰島背部皮下預(yù)血管化處移植。①A組：微膠囊大鼠胰島移植組；②B組：大鼠胰島移植組；③C組：空囊組。每周觀察受體小鼠的血糖和體重變化。移植后8周，將糖尿病小鼠處死，行受體移植部位組織學研究。 結(jié)果：1，A

8、組血糖于移植后5天下降，7天下降至有效范圍，并維持到實驗結(jié)束時8周。B組血糖移植后明顯下降，但未降至成模前正常小鼠非空腹血糖水平，移植3周后升至成模時血糖水平。C組和D組移植后血糖與成模時血糖相比較均無明顯差異，移植無效；2，組織切片提示微膠囊囊壁完整，囊周無明顯淋巴細胞浸潤。 結(jié)論：1，新型緩釋bFGF微囊小鼠皮下預(yù)血管化大鼠胰島移植可有效緩解化學性糖尿病小鼠高血糖狀態(tài)，移植創(chuàng)傷小，可反復(fù)進行，而且具有觀察容易、移植的微膠囊易

9、回收和回收率高的特點；2，海藻酸鈉微膠囊可有效保護囊內(nèi)胰島，為異種胰島移植創(chuàng)造了必要的條件。 第四部分大鼠胰島與bFGF共微囊提高移植胰島活性的實驗研究 目的：探討bFGF與大鼠胰島共微囊對提高皮下移植功效的作用。 方法：選取C57BL/6雄性小鼠10只，建立皮下預(yù)血管化糖尿病小鼠模型，行微膠囊大鼠胰島皮下移植。隨機分為2組，每組5只。①A組：bFGF與大鼠胰島共微囊移植組；②B組：微膠囊大鼠胰島移植組。觀察受體

10、小鼠的血糖和體重變化，移植后8周將糖尿病小鼠處死，取出微膠囊，用雙硫腙(DTZ)染色法判定和比較微膠囊內(nèi)大鼠胰島存活數(shù)。 結(jié)果：A組和B組間各時間點小鼠血糖均無顯著差異(P>0.05)。A組和B組間各實驗點小鼠體重均無顯著差異(P>0.05)。小鼠體重成模時下降，移植2周后開始上升，上升曲線與正常小鼠相似。B組、C組和D組糖尿病小鼠體重隨移植后時間延長逐漸減輕。移植后8周后胰島存活數(shù)，兩組間有非常顯著差異(t=8.22，P<0.

11、01)，bFGF共微膠囊大鼠胰島移植組胰島存活數(shù)較對照組多。 結(jié)論：小鼠皮下預(yù)血管化bFGF與大鼠胰島共微膠囊移植治療化學性糖尿病小鼠可有效緩解化學性糖尿病小鼠高血糖狀態(tài)，囊內(nèi)bFGF的局部血管新生作用可明顯提高微膠囊內(nèi)胰島存活率。 第五部分大鼠胰島與GF共微囊改善移植胰島功效的實驗研究 目的：探討GF與大鼠胰島共微囊對提高囊內(nèi)胰島存活率的作用。 方法：選取C57BL/6雄性小鼠皮下預(yù)血管化后建立糖尿病模

12、型15只，行微膠囊大鼠胰島皮下移植。隨機分為3組，每組5只。①A組：GF與大鼠胰島共微囊移植組；②B組：微膠囊大鼠胰島移植組；③C組：GF微囊移植組。觀察受體小鼠的血糖和體重變化，移植后8周比較微膠囊內(nèi)胰島存活數(shù)。 結(jié)果：移植后1周至移植后3周A組與B組間血糖均有非常顯著差異(P<0.01)，移植后4周至移植后8周A組與B組間血糖無顯著差異(P>0.05)，移植后1周至移植后4周B組與C組間血糖均有非常顯著差異(P<0.01)。

13、C組血糖異常升高，移植4周后小鼠陸續(xù)死亡。A組和B組間各實驗點小鼠體重均無顯著差異(P>0.05)，A組小鼠體重成模時下降，移植2周后開始上升，上升曲線與正常小鼠相似。A組和B組胰島存活數(shù)有非常顯著差異(F=36．84，P<0.01)，大鼠胰島與GF共微膠囊移植后8周胰島存活數(shù)明顯多于對照組。 結(jié)論：GF與大鼠胰島共微膠囊移植，GF可促進胰島的細胞增殖和再生，顯著提高囊內(nèi)胰島的存活率。移植后1周至移植后3周A組血糖較高可能是GH

14、的緩釋作用所致。 第六部分大鼠胰島與NGF共微囊提高移植胰島存活率的實驗研究 目的：探討NGF與大鼠胰島共微囊對提高皮下移植胰島功效的作用。 方法：選取C57 BL/6雄性小鼠皮下預(yù)血管糖尿病模型10只，行微膠囊大鼠胰島皮下移植。隨機分為2組，每組5只。①A組：NGF與大鼠胰島共微囊組：②B組：微膠囊大鼠胰島組。觀察受體小鼠的血糖和體重變化，移植后8周比較微膠囊內(nèi)胰島存活數(shù)。 結(jié)果：A組和B組間各時間點小