核仁蛋白PAKLIPL參與細(xì)胞周期進(jìn)程及核糖體生物發(fā)生的調(diào)控研究.pdf

1、細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖在生命的整個(gè)過(guò)程中都受到精密而嚴(yán)格的調(diào)控。一個(gè)具有正常功能的器官依賴(lài)于一個(gè)內(nèi)在的平衡來(lái)維持恰當(dāng)?shù)募?xì)胞數(shù)目。細(xì)胞增殖和死亡就是維持這個(gè)內(nèi)在平衡的具體表現(xiàn)。細(xì)胞增殖受到細(xì)胞周期各個(gè)環(huán)節(jié)的高度調(diào)控,其中G1/S檢驗(yàn)點(diǎn)是最主要的調(diào)控開(kāi)關(guān)之一。在G1/S期轉(zhuǎn)折點(diǎn),細(xì)胞針對(duì)不同的胞內(nèi)外信號(hào)作出反應(yīng),促使細(xì)胞在周期中做出反應(yīng),即細(xì)胞分裂、G1期阻滯、生長(zhǎng)停滯或者細(xì)胞分化等。這個(gè)檢驗(yàn)點(diǎn)發(fā)生任何故障(例如癌基因的激活或者抑癌基因的失活),將

2、會(huì)導(dǎo)致不正常的細(xì)胞增殖或轉(zhuǎn)化,最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。TP53是我們最為熟知的最重要的抑癌基因之一,大約50％以上的人類(lèi)癌癥中存在p53的突變。而剩下50％的癌癥也有一部分是由于調(diào)節(jié)p53蛋白的因子表達(dá)或功能異常所致,比如MDM2基因。在大約7％的癌癥中,雖然p53基因沒(méi)有發(fā)生突變,但是MDM2基因表達(dá)上調(diào)使p53蛋白水平下降從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。正常細(xì)胞中,p53的蛋白水平主要受到MDM2調(diào)控。MDM2通過(guò)泛素化p53蛋白,促使其進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)

3、而降解,從而p53蛋白維持在一個(gè)相對(duì)較低的狀態(tài)。P53又能結(jié)合在MDM2的啟動(dòng)子上,直接激活MDM2的表達(dá),形成一個(gè)反饋調(diào)節(jié)的機(jī)制。在遇到不同的生理壓力時(shí),比如DNA損傷,促癌基因和核仁的壓力(ribosomal stress),MDM2表達(dá)下調(diào)或者活性被抑制,而導(dǎo)致p53蛋白的穩(wěn)定并且持續(xù)激活使細(xì)胞周期阻滯,凋亡,DNA修復(fù)或者衰老。
　　 核仁/核糖體壓力主要由于rRNA合成和加工以及核糖體組裝等核糖體生物發(fā)生受到干擾而產(chǎn)生

4、。近年來(lái)已經(jīng)報(bào)道,5-氟尿嘧啶、低劑量的放線(xiàn)菌素D、血清饑餓、核仁或者核糖體蛋白的破壞均可以導(dǎo)致核糖體壓力而使p53激活。在核糖體壓力應(yīng)答中,有一些核仁蛋白nucleophosmin(NPM),nucleostemin(NS),L5,L11。L23以及S7均能與MDM2蛋白結(jié)合而抑制其活性,使p53穩(wěn)定而活化。因此,核仁蛋白在核糖體生物發(fā)生以及將核仁壓力的信號(hào)傳導(dǎo)至p53信號(hào)途徑中起著非常關(guān)鍵的作用。
　　 PAK1IP1基因包

5、含5個(gè)G蛋白β亞基類(lèi)似結(jié)構(gòu)WD40的重復(fù)基序,并與酵母中的Mak11和Skb15蛋白具有高度同源性,且酵母中的這兩個(gè)蛋白對(duì)于細(xì)胞的存活是必需的。2007年已有研究報(bào)道將小鼠的PAK1IP1異位表達(dá)在酵母中能夠替代Skb15的功能。2001年曾報(bào)道PAK1IP1廣泛表達(dá)在人類(lèi)大部分組織中,并能對(duì)PAK1信號(hào)途徑起著負(fù)調(diào)節(jié)作用。PAK1是一個(gè)與細(xì)胞增值、存活、分裂以及轉(zhuǎn)錄相關(guān)的激酶,PAK1IP1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的功能并不清楚。
　　

6、 本實(shí)驗(yàn)在前人的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步的假設(shè)和論證,對(duì)PAK1IP1具體生理功能和機(jī)制進(jìn)行了一系列研究。共分為以下三個(gè)部分:
　　 1.核仁蛋白PAK1IP1亞細(xì)胞定位及其在細(xì)胞中表達(dá)分析運(yùn)用生物信息學(xué)網(wǎng)站在線(xiàn)分析,在PAK1IP1的C端(371-389aa)發(fā)現(xiàn)一個(gè)核/核仁定位信號(hào)(KKRKMVEMLEKKRKKKKIK)。于是我們克隆了人類(lèi)PAK1IP1全長(zhǎng)基因,將其連入融合了GFP的真核表達(dá)載體中,通過(guò)熒光顯微鏡觀(guān)察,發(fā)現(xiàn)

7、PAK1IP1是一個(gè)核仁蛋白,少部分分布在核質(zhì)而主要聚集在核仁區(qū)。通過(guò)定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建了一系列PAK1IP1突變體,發(fā)現(xiàn)PAK1IP1蛋白C端371-389aa是核定位信號(hào),而3個(gè)KKXK序列是其核仁定位必不可少的。
　　 首先我們利用核仁壓力誘導(dǎo)化合物5氟尿嘧啶和低劑量放線(xiàn)菌素處理Hela細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)PAK1IP1的蛋白水平隨藥物劑量依賴(lài)性增加,而mRNA水平并不受影響。我們進(jìn)一步利用胸腺嘧啶脫氧核苷對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期

8、的雙重阻斷法分析,檢測(cè)到PAK1IP1其轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均呈現(xiàn)細(xì)胞周期依賴(lài)性變化。PAK1IP1在靜止和生長(zhǎng)期的細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)而在增殖分裂細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)的模式。表明PAK1IP1能感應(yīng)核仁壓力且呈現(xiàn)細(xì)胞周期依賴(lài)性表達(dá)模式。
　　 2.PAK1IP1調(diào)節(jié)p53穩(wěn)定性參與細(xì)胞周期調(diào)控我們采用了慢病毒表達(dá)系統(tǒng),將PAK1IP1全長(zhǎng)及各不同細(xì)胞定位的缺失突變體片段連入了pLL3.7慢病毒載體。通過(guò)病毒顆粒感染靶細(xì)胞,首先我們以細(xì)胞計(jì)數(shù)

9、、MTS細(xì)胞活性分析、以及克隆形成的方法檢測(cè)到過(guò)表達(dá)PAK1IP1抑制了U2OS細(xì)胞增殖和活性,同時(shí)核仁定位突變體功能與野生型相似,而核定位的突變體并不影響細(xì)胞增殖。同時(shí)野生型PAK1IP1對(duì)克隆形成的抑制作用比核仁定位突變體更明顯。為了檢測(cè)這種細(xì)胞增殖的影響是否與細(xì)胞中p53表達(dá)相關(guān),我們?cè)趐53野生型和缺失型細(xì)胞系中進(jìn)一步用克隆形成方法發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)PAK1IP1只對(duì)p53野生型細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制的功能。
　　 通過(guò)BrdU摻入以

10、及細(xì)胞周期分析的方法,我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)PAK1IP1通過(guò)抑制DNA的合成抑制了細(xì)胞增殖,推遲了細(xì)胞周期G1/S期進(jìn)程,而在p53被干擾及缺失型細(xì)胞中并沒(méi)有影響。結(jié)果表明PAK1IP1的高表達(dá)減慢了細(xì)胞周期G1/S期進(jìn)程且呈現(xiàn)p53依賴(lài)性的細(xì)胞增殖抑制。
　　 進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)PAK1IP1上調(diào)了p53及其下游的蛋白水平,該現(xiàn)象也在核仁定位信號(hào)突變體過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中出現(xiàn),而沒(méi)有發(fā)生在核定位信號(hào)缺失突變體中。為了證明p53蛋白水

11、平上調(diào)是由于合成加快或者是降解減緩引起的,我們利用放線(xiàn)菌酮抑制細(xì)胞中蛋白合成并觀(guān)察p53半衰期變化,發(fā)現(xiàn)p53在過(guò)表達(dá)PAK1IP1的細(xì)胞中半衰期明顯延長(zhǎng)了數(shù)小時(shí),表明PAK1IP1穩(wěn)定了p53蛋白水平。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)免疫沉淀方法證明了不管是內(nèi)源還是外源的PAK1IP1均能與MDM2相互作用,且在進(jìn)一步外源基因的轉(zhuǎn)染和泛素化分析中,證明了核定位的而非胞漿定位的PAK1IP1抑制了MDM2對(duì)p53的泛素化降解。
　　 3.PAK1IP

12、1參與核糖體生物發(fā)生的功能及機(jī)理研究利用慢病毒干擾系統(tǒng),我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)PAK1IP1 mRNA的2個(gè)shRNA序列,并驗(yàn)證其中shRNA2是有效的。
　　 首先我們通過(guò)生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定,細(xì)胞存活能力分析以及克隆形成分析中發(fā)現(xiàn)PAK1IP1沉默后非常顯著地抑制了細(xì)胞增殖。令人驚奇的是,PAK1IP1沉默后對(duì)p53野生型細(xì)胞和缺陷型細(xì)胞均存在生長(zhǎng)抑制的能力,但在p53野生型細(xì)胞中作用更顯著。然后我們通過(guò)Western blot和免疫熒光

13、染色方法證明了p53的激活,且發(fā)現(xiàn)PAK1IP1沉默同樣使細(xì)胞周期G1/S期受到阻滯。
　　 由前文得知PAK1IP1能感應(yīng)核糖體壓力而上調(diào),我們想知道是否PAK1IP1沉默后能激活核糖體蛋白-MDM2-p53信號(hào)通路,通過(guò)蔗糖梯度離心發(fā)現(xiàn)在PAK1IP1沉默的細(xì)胞中游離的核糖體蛋白L5和L11明顯增加,并通過(guò)免疫共沉淀得出這些核糖體蛋白與MDM2的相互作用顯著增強(qiáng)。這表明了PAK1IP1在細(xì)胞中的沉默可能引發(fā)了核糖體壓力。利用

14、蔗糖密度梯度離心,Northern雜交以及活細(xì)胞氚標(biāo)記示蹤分析,我們進(jìn)一步證實(shí)了PAK1IP1在干擾的情況下抑制了28SrRNA的加工,從而減少了60S核糖體的組裝。結(jié)果表明,PAK1IP1在細(xì)胞中的沉默減少了核糖體的組裝從而誘發(fā)核糖體壓力,抑制細(xì)胞增殖。
　　 綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的能感應(yīng)核仁壓力的核仁蛋白PAK1IP1,該蛋白通過(guò)p53-MDM2信號(hào)途徑參與了細(xì)胞周期調(diào)控,并揭示了PAK1IP1核仁蛋白表達(dá)的平衡在細(xì)胞