人巨細胞病毒潛伏激活診斷試劑盒的研制和相關研究.pdf

1、目的:制備人巨細胞病毒pp65抗原血癥檢測試劑盒，并對pp65蛋白在外周血白細胞內的定位及意義進行探討。建立檢測HCMV pp65抗體的間接ELISA方法。 方法:以重組表達的HCMV pp65蛋白為抗原，運用雜交瘤技術制備單抗，對篩選獲得的單抗進行鑒定，并以間接免疫熒光法與進口同類產品進行比較；將自制小鼠IgG免疫家兔獲得的二抗進行標記，獲得完整的檢測試劑盒，以間接免疫熒光法與進口同類產品進行比較；通過DAPI染色、間接免疫熒

2、光法和共聚焦顯微鏡掃描三者結果共同確定HCMV pp65 蛋白在細胞中的定位，并對部分移植患者進行動態(tài)跟蹤；以重組表達蛋白HCMV pp65為抗原，建立間接ELISA法檢測其特異性IgG型抗體，并對不同人群的檢測結果進行分析。 結果:獲得3株針對HCMV pp65蛋白的單抗，即B6、G12、2B12；Ig亞型依次為IgG1k型、IgG1k型、IgMk型；親合常數依次為3.6×107L/mol、3.8×107L/mol、3.1×1

3、08 L/mol。免疫印跡試驗結果表明3株單抗都與HCMV pp65蛋白特異性的結合，除2B12外，B6、G12與EBV、HSV 1、HSV 2均無交叉反應；與進口單抗平行檢測140份臨床標本，結果一致。與自行標記異硫氰酸熒光素的二抗配套檢測HCMV pp65抗原，并以免疫熒光檢測法與進口同類產品進行比較，通過與進口同類試劑盒平行檢測16份臨床標本，結果一致；結合DAPI染色、間接免疫熒光法和共聚焦顯微鏡掃描結果，發(fā)現陽性細胞有胞漿陽性

4、、胞核陽性和核漿陽性3種表現形式，對于胞核陽性的細胞，pp65蛋白主要定位在細胞核內，非核膜部分；間接ELISA法檢測HCMV pp65-IgG的最佳包被抗原濃度為10ng/孔，酶標二抗的工作濃度為1:3000。當陽性判斷值A為0.298時，87份不同組的血清標本（HCMV感染活動組、HCMV感染不活動組、HCMV未感染組）陽性檢出率分別為51.6％、12.1％和0。三組兩兩間均存在顯著性差異（P<0.01）。 結論:自制檢測試