GM1、神經(jīng)營養(yǎng)因子和骨骼肌對DRG神經(jīng)元表型影響的實驗研究.pdf

1、神經(jīng)肽免疫反應（neuropeptide-immunoreactive，NP-IR）神經(jīng)元和神經(jīng)絲免疫反應（neurofilament-immunoreactive，NF-IR）神經(jīng)元是背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）神經(jīng)元的兩個主要表型。NP-IR神經(jīng)元周圍突屬于無髓或薄髓纖維，分布于內(nèi)臟和皮膚，可以合成并釋放P物質(zhì)（substance P， SP）等生物活性物質(zhì)。NF-IR神經(jīng)元周圍突則屬于有髓纖維，分

2、布于肌梭，主要參與牽張反射刺激，與本體感覺的信息傳遞有關。SP是DRG神經(jīng)元內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)元的胞體內(nèi)合成，經(jīng)軸突運輸至神經(jīng)末梢，在炎癥、應激等刺激下釋放，發(fā)揮生物學效應。神經(jīng)絲是神經(jīng)元細胞骨架結(jié)構的一個重要組成部分，參與維持神經(jīng)元正常的形態(tài)結(jié)構。神經(jīng)絲主要有輕（NF-L）、中（NF-M）、重（NF-H）三種亞型，其分子量分別為68 kDa，160 kDa和200 kDa。神經(jīng)絲-200（neurofilament200，NF-20

3、0）是構成軸突的主要骨架結(jié)構，在DRG神經(jīng)元發(fā)育過程中有表達，是NF-IR神經(jīng)元表型的一個重要指標。 單涎性神經(jīng)節(jié)苷脂（monosiaganglioside， GM1）在神經(jīng)元的發(fā)育，分化和存活等生理狀態(tài)和病理狀態(tài)下均具有營養(yǎng)作用。體內(nèi)與體外實驗皆表明，GM1可以發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)因子樣作用。體外實驗表明，神經(jīng)元誘導分化過程中伴隨著GM1生物合成的改變和核膜GM1含量的增高。 神經(jīng)營養(yǎng)因子（neurotrophins，NTs）

4、在周圍神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和存活中具有重要的調(diào)節(jié)作用。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor， NGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor， BDNF）和神經(jīng)營養(yǎng)素-3（neurotrophin-3，NT-3）都是NTs家族的成員。研究表明，外源性應用這些營養(yǎng)因子可以保護受損神經(jīng)元，刺激軸突再生。 NGF在感覺神經(jīng)元的發(fā)育過程中，對于初級傳入神經(jīng)元的存活和表型的形成

5、具有重要的影響作用。體外培養(yǎng)成年DRG感覺神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)，部分DRG感覺神經(jīng)元的神經(jīng)肽表型是固有的，并且其表犁的表達程度可以由NGF來調(diào)節(jié)。在DRG神經(jīng)元受損時，NGF還可以逆轉(zhuǎn)具有高親和力NGF受體的DRG神經(jīng)元中神經(jīng)絲mRNA的減少。 BDNF在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中起著重要的作用，可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活、生長和分化。在DRG感覺神經(jīng)元中，BDNF主要存在于小型和中型亞群DRG感覺神經(jīng)元，可以順向轉(zhuǎn)運至神經(jīng)元的周圍突和中

6、樞突。體內(nèi)實驗表明，BDNF的存在對于DRG感覺神經(jīng)元的存活和功能的維持具有非常重要的作用。體外實驗也表明，部分感覺神經(jīng)元的存活依賴于BDNF的存在。 NT-3可作為促細胞分裂因子或誘導神經(jīng)元分化的因子，維持胚胎發(fā)育中神經(jīng)元的存活，并促進其分化與增殖。NT-3在感覺神經(jīng)元和交感神經(jīng)元的存活和分化，以及神經(jīng)突起發(fā)生、突觸形成和軸突生長中均具有非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，DRG感覺神經(jīng)元可能是脊髓神經(jīng)營養(yǎng)因子如NT-3的來源之一，并

7、且在脊髓損傷后DRG感覺神經(jīng)元內(nèi)的NT-3可以順行轉(zhuǎn)運至脊髓，有利于脊髓神經(jīng)元的再生。 靶組織在維持神經(jīng)元的功能和神經(jīng)-肌間的信息傳遞中，發(fā)揮著重要作用。運動神經(jīng)元與其支配的骨骼?。╯keletal muscle，SKM）之間具有密切的相互依賴關系。兩種組織之間的重要信息傳遞是由神經(jīng)-肌接頭（neuromuscular junction，NMJ）介導的。在這兩種組織的其它部位釋放和接收各種因子也是它們之間相互影響的一種方式。神經(jīng)

8、.肌之間的信息傳遞之一是神經(jīng)營養(yǎng)因子和其他分子的相互交換。體外實驗發(fā)現(xiàn)，新生哺乳動物NF-IR陽性DRG神經(jīng)元，需要SKM提取物中的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子來維持其存活。實驗表明，在神經(jīng)元的發(fā)育過程中，靶源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對于支配肌細胞的不同神經(jīng)元的存活和分化具有重要的生物學作用。感覺神經(jīng)末梢可以為去神經(jīng)支配肌組織提供神經(jīng)營養(yǎng)因子，SKM的肌梭也受DRG感覺神經(jīng)元支配。 GM1、NGF、BDNF、NT-3和靶組織SKM對維持神經(jīng)元的功能

9、都發(fā)揮重要的作用。然而，GM1、NGF、BDNF、NT-3單獨應用或與靶組織SKM聯(lián)合應用是否影響DRG感覺神經(jīng)元的表型目前尚不清楚?；谝陨涎芯勘尘?，本研究在體外建立DRG神經(jīng)元單純培養(yǎng)和DRG神經(jīng)元與SKM細胞聯(lián)合培養(yǎng)的細胞模型，通過檢測體外培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中SP-IR和NF-200-IR神經(jīng)元的表達情況，來分析GMI、NGF、BDNF、NT-3和SKM細胞單獨應用以及GM1、NGF、BDNF、NT-3分別與SKM細胞聯(lián)合應用對D

10、RG神經(jīng)元表型的影響作用，為初級傳入神經(jīng)元表型變化的發(fā)育神經(jīng)生物學提供新的理論和實驗依據(jù)。 第一部分GM1和骨骼肌對培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元表型的影響作用 胚胎第12.5天（embryonic day12.5，E12.5）和胚胎第19.5天（embryonic day19.5，E19.5）的大鼠DRG神經(jīng)元，分別進行體外單純分散培養(yǎng)以及與SKM細胞的聯(lián)合培養(yǎng)，體外培養(yǎng)2d后，分為8組。（1）E12.5對照組：E12.5DRG神

11、經(jīng)元單純培養(yǎng)，不施加任何干預因素，繼續(xù)在培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)4d；（2）E19.5對照組：E19.5DRG神經(jīng)元單純培養(yǎng)，不施加任何干預因素，繼續(xù)在培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)4 d；（3）E12.5GM1組：E12.5DRG神經(jīng)元單純培養(yǎng)，用GM1（終濃度10μg/ml）孵育4 d；（4）E19.5GM1組：E19.5DRG神經(jīng)元單純培養(yǎng)，用GM1（終濃度10μg/ml）孵育4 d；（5）E12.5SKM組：E12.5DRG神經(jīng)元與SKM細胞聯(lián)合培養(yǎng)，不施加

12、任何干預因素，繼續(xù)培養(yǎng)4 d；（6）E19.5SKM組：E19.5DRG神經(jīng)元與SKM細胞聯(lián)合培養(yǎng)，不施加任何干預因素，繼續(xù)培養(yǎng)4 d：（7）E12.5GM1+SKM組：E12.5DRG神經(jīng)元與SKM細胞聯(lián)合培養(yǎng)，用GM1（終濃度10μg/ml）孵育4 d；（8）E19.5GM1+SKM組：E19.5DRG神經(jīng)元與SKM細胞聯(lián)合培養(yǎng)，用GMI（終濃度10μg/ml）孵育4d。在培養(yǎng)過程中，用倒置相差顯微鏡動態(tài)觀察各組標本在不同時間的生長

13、狀態(tài)。終止培養(yǎng)后，用掃描電子顯微鏡觀察單純培養(yǎng)中DRG神經(jīng)元胞體、突起及神經(jīng)末梢的形態(tài)以及聯(lián)合培養(yǎng)中DRG神經(jīng)元胞體、突起的形態(tài)以及神經(jīng)末梢與SKM之間的關系；用免疫熒光雙標技術來檢測單純培養(yǎng)和聯(lián)合培養(yǎng)中DRG神經(jīng)元中SP-IR和NF-200-IR神經(jīng)元的表達變化。 實驗結(jié)果如下： （1）倒置相差顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，DRG神經(jīng)元的突起跨過SKM細胞或者到達并分布于SKM細胞表面，在SKM細胞自發(fā)性收縮的牽動下，

14、DRG神經(jīng)元的突起也隨之移動。 （2）GM1可以促進體外分散培養(yǎng)的E12.5DRG神經(jīng)元中SP和NF-200的表達（P<0.05），而不能促進體外分散培養(yǎng)的E19.5DRG神經(jīng)元中SP和NF-200的表達。 （3）靶組織SKM細胞可以促進體外培養(yǎng)的E12.5 DRG神經(jīng)元中NF-200的表達（P<0.05）而不能促進SP的表達；靶組織SKM細胞對體外培養(yǎng)的E19.5DRG神經(jīng)元中SP和NF-200的表達無影響作用。 （

15、4）GM1和靶組織SKM細胞對促進E12.5DRG神經(jīng)元SP和NF-200的表達具有協(xié)同作用（P<0.001）；而GM1和靶組織SKM細胞對E19.5DRG神經(jīng)元SP和NF-200的表達無影響作用。 第二部分神經(jīng)營養(yǎng)因子和骨骼肌對培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元表型的影響作用 體外培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元取自Wistar大鼠第12.5 d的胚胎。無菌條件下進行體外DRG神經(jīng)元單純培養(yǎng)以及與SKM細胞的體外聯(lián)合培養(yǎng)，體外培養(yǎng)2d后，分為8組。

16、（1）對照組：單純培養(yǎng)的胎鼠DRG神經(jīng)元，不施加任何干預因素，繼續(xù)在培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)4d；（2）NGF組：單純培養(yǎng)的胎鼠DRG神經(jīng)元，用NGF（10 ng/ml）孵育4d；（3）BDNF組：單純培養(yǎng)的胎鼠DRG神經(jīng)元，用BDNF（10 ng/ml）孵育4d；（4）NT-3組：單純培養(yǎng)的胎鼠DRG神經(jīng)元，用NT-3（10 ng/ml）孵育4d；（5）SKM組：胎鼠DRG神經(jīng)元與SKM細胞聯(lián)合培養(yǎng)，不施加任何干預因素，繼續(xù)在培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)4 d；

17、（6）SKM+NGF組：胎鼠DRG神經(jīng)元與SKM細胞聯(lián)合培養(yǎng)，用NGF（10 ng/ml）孵育4 d；（7）SKM+BDNF組：胎鼠DRG神經(jīng)元與SKM細胞聯(lián)合培養(yǎng)，用BDNF（10 ng/ml）孵育4 d；（8）SKM+NT-3組：胎鼠DRG神經(jīng)元與SKM細胞聯(lián)合培養(yǎng)，用NT-3（10 ng/ml）孵育4d。在培養(yǎng)過程中，用倒置相差顯微鏡動態(tài)觀察各組標本在不同時間的生長狀態(tài)。終止培養(yǎng)后，用免疫熒光雙標技術檢測單純和聯(lián)合培養(yǎng)中DRG神經(jīng)