人胎兒角膜上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)和性質(zhì)鑒定.pdf

1、目的：建立人胎兒角膜上皮細(xì)胞體外原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)方法，優(yōu)化人胎兒角膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)體系，為構(gòu)建組織工程角膜提供上皮種子細(xì)胞。 方法：一.人胎兒角膜上皮原代和傳代培養(yǎng)。1、原代培養(yǎng)，嚴(yán)格無(wú)菌操作獲取人胎兒角膜片，采用組織塊貼壁法（角膜緣部、中央部）、酶消化法原代培養(yǎng)人胎兒角膜上皮細(xì)胞。2、傳代培養(yǎng)。角膜緣部的細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80％以上，不同稀釋濃度的胰酶/EDTA消化液消化傳代分別接種于空板、小鼠3T3成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層、胎兒角膜基

2、質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層及HTK飼養(yǎng)層，培養(yǎng)液分別采用D/F12、小鼠3T3成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液、胎兒角膜基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液、HTK條件培養(yǎng)液。二、人胎兒角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系的條件優(yōu)化.1、三種條件培養(yǎng)液蛋白含量測(cè)定與細(xì)胞增殖檢測(cè).將收集的小鼠3T3成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液、胎兒角膜基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液、HTK條件培養(yǎng)液使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定樣品的蛋白含量。設(shè)D/F12為對(duì)照組，MTT法檢測(cè)3T3條件培養(yǎng)液、胎兒角膜基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液、HTK條件培

3、養(yǎng)液對(duì)人角膜上皮細(xì)胞系的增殖能力。2、牛角膜細(xì)胞破碎液蛋白含量測(cè)定與細(xì)胞增殖檢測(cè).將收集的牛角膜上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞三種細(xì)胞破碎液原液使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定樣品的蛋白含量。設(shè)D/F12為對(duì)照組，MTT法檢測(cè)含5％、10％、20％不同濃度的三種牛角膜細(xì)胞破碎液對(duì)人角膜上皮細(xì)胞系的增殖能力。三、人胎兒角膜上皮細(xì)胞的性質(zhì)鑒定.將P3代人胎兒角膜上皮細(xì)胞用K3/12抗體進(jìn)行熒光染色，觀察傳代細(xì)胞是否還保持有角膜上皮細(xì)胞的特性。收集

4、P3代人胎兒角膜上皮細(xì)胞總RNA，用角膜基質(zhì)細(xì)胞作為陰性對(duì)照，檢測(cè)K12、Pax6、K15、ABCG2和P75在mRNA水平上的表達(dá)情況。 結(jié)果：一、人胎兒角膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)情況觀察.1、原代培養(yǎng).角膜緣部組織塊周圍遷出的細(xì)胞以圓形或卵圓形為主，排列緊密，生長(zhǎng)狀態(tài)良好；中央部的角膜上皮細(xì)胞體積大，以大而扁平的類表層上皮細(xì)胞為主，生長(zhǎng)狀態(tài)差；消化法培養(yǎng)可觀察到上皮消化成單細(xì)胞懸液，但接種后無(wú)細(xì)胞貼壁。2、細(xì)胞傳代，觀察不同濃度消化

5、液消化傳代的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，采用0.05％胰酶+0.02.EDTA消化可觀察到消化后的細(xì)胞大部分成單細(xì)胞狀態(tài)，傳代培養(yǎng)后細(xì)胞貼壁及增殖良好。接于HTK飼養(yǎng)層和胎兒角膜基質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層上的細(xì)胞不易貼壁且細(xì)胞不增殖，接于3T3飼養(yǎng)層上的細(xì)胞克隆生長(zhǎng)，增殖能力強(qiáng)，但繼續(xù)傳代后細(xì)胞老化，不再增殖，容易有角膜基質(zhì)細(xì)胞污染。采用D/F12、HTK條件培養(yǎng)液及胎兒角膜基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞增殖能力弱，逐漸老化，不能繼續(xù)傳代；采用3T3條件培養(yǎng)液培養(yǎng)，培

6、養(yǎng)3天后，可見(jiàn)形態(tài)規(guī)則的卵圓形小細(xì)胞集落分布于不規(guī)則的大細(xì)胞間，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)。傳至P4代胎兒角膜上皮細(xì)胞仍有較強(qiáng)增殖能力，但小細(xì)胞明顯減少。二、人胎兒角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系的條件優(yōu)化.1、三種條件培養(yǎng)液對(duì)人角膜上皮細(xì)胞增殖的影響.用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)3T3條件培養(yǎng)液、胎兒角膜基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液、HTK條件培養(yǎng)液進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，結(jié)果顯示3T3條件培養(yǎng)液組蛋白含量最高。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示3T3條件培養(yǎng)液可明顯促進(jìn)HCEC的增殖，其與

7、胎兒角膜基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液、HTK條件培養(yǎng)液和D/F12三組差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、三種牛角膜細(xì)胞破碎液對(duì)人角膜上皮細(xì)胞增殖的影響，用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)牛角膜上皮、基質(zhì)及內(nèi)皮細(xì)胞破碎液液體進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，結(jié)果顯示牛角膜上皮細(xì)胞破碎液為914μg/ml，牛角膜基質(zhì)細(xì)胞破碎液為953μg/ml，牛內(nèi)皮細(xì)胞破碎細(xì)胞液為1252μg/ml。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示5％的牛上皮細(xì)胞破碎液、5％、10％牛基質(zhì)細(xì)胞破碎液、10％牛內(nèi)皮細(xì)胞破碎

8、液均可明顯促進(jìn)HCEC的增殖，四組與D/F12之間差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，四組問(wèn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、人胎兒角膜上皮細(xì)胞的性質(zhì)鑒定.1、免疫熒光染色可見(jiàn)P3代的人胎兒角膜上皮細(xì)胞K3/12染色陽(yáng)性。2、RT-PCR檢測(cè)顯示，P3代人胎兒角膜上皮細(xì)胞在mRNA水平上有K12、K15、Pax6、P75和ABCG2的高表達(dá)，而角膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)較弱。 結(jié)論：一、組織塊貼壁法原代培養(yǎng)人胎兒角膜上皮細(xì)胞以及小鼠3T3成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液傳代