褪黑素對體內(nèi)體外高脂誘導(dǎo)胰島素抵抗的預(yù)防作用及機(jī)制研究.pdf

1、2型糖尿病的發(fā)病主要是在遺傳基礎(chǔ)上綜合多種環(huán)境因素的結(jié)果，其中高糖高脂飲食是一種重要的環(huán)境因素。2型糖尿病的主要臨床特征是胰島素抵抗及胰島β細(xì)胞分泌功能異常，其中胰島素抵抗是致病的主要因素，貫穿于其發(fā)生、發(fā)展的整個(gè)過程。
　　 已知肥胖所致的血漿游離肪酸濃度(FFA)增高是引起胰島素抵抗和的重要危險(xiǎn)因素之一。流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室研究表明，飲食中脂肪攝入過多或脂肪過量儲(chǔ)存（肥胖）均可導(dǎo)致胰島素抵抗，血漿游離脂肪酸（FFA）濃度與肥

2、胖、2型糖尿病等多種胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)相關(guān)，血漿升高的FFA是導(dǎo)致胰島素抵抗的決定性因素，也是胰島素抵抗脂毒學(xué)說的重要內(nèi)容。
　　 肝臟是機(jī)體調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和脂代謝的重要器官，有研究發(fā)現(xiàn)FFA 能促進(jìn)肝臟葡萄糖輸出,降低肝臟對胰島素的敏感性，誘導(dǎo)肝臟胰島素抵抗。肝臟是胰島素作用的一個(gè)重要靶器官，肝臟中胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的缺陷，會(huì)直接關(guān)系到全身胰島素抵抗的發(fā)生和2型糖尿病的發(fā)病，因此對肝臟胰島素抵抗發(fā)生機(jī)理和預(yù)防的研究已越來越受到人們

3、的重視，隨著研究不斷的深入，將有利于我們進(jìn)一步了解2型糖尿病的發(fā)病機(jī)理，并探尋早期預(yù)防方法。
　　 營養(yǎng)過剩和體力活動(dòng)減少導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)葡萄糖和游離脂肪酸升高，線粒體的能量轉(zhuǎn)換加快，自由基（ROS）的生成增加導(dǎo)致細(xì)胞氧化還原狀態(tài)失衡，使細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激。許多證據(jù)顯示，氧化應(yīng)激參與了胰島素抵抗的形成，氧化應(yīng)激也是糖尿病各種慢性并發(fā)癥的共同基礎(chǔ)，是2型糖尿病的重要致病因素。提高機(jī)體的抗氧化能力應(yīng)該可以對抗高血糖和高游離脂肪酸的這種作用。

4、
　　 L02細(xì)胞源于人胚胎肝細(xì)胞，保留了原代肝細(xì)胞的許多基本表型和功能，包括細(xì)胞膜成分、代謝通路、生理濃度的各種酶以及活性基因表達(dá)，是很好的研究肝臟代謝和胰島素信號傳導(dǎo)的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　 本課題體外實(shí)驗(yàn)以L02細(xì)胞為研究對象，用飽和脂肪酸軟脂酸(palmitate,PA)和多不飽和脂肪酸亞油酸（Linoleic acid，LA）孵育L02細(xì)胞，誘導(dǎo)L02細(xì)胞胰島素抵抗。為觀察FFA對胞內(nèi)胰島素信號通路的影響，對胰島

5、素信號傳遞的主要蛋白如胰島素受體(IR)、胰島素受體底物IRS1/2、蛋白激酶B(PKB)、糖原合酶激酶3β(GSK-3β)、S6K、FOXO1等的活性變化進(jìn)行檢測；為觀察FFA對細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御體系的影響，對細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS 水平以及ROS活化的氧化應(yīng)激敏感激酶c-Jun 氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase）JNK活性進(jìn)行測定；在PA 孵育同時(shí)加入褪黑素（melatonin），一種體內(nèi)最強(qiáng)抗氧化作用的自由基

6、清除劑，測定以上同樣指標(biāo)，觀察褪黑素是否能影響胰島素信號的傳遞而改善胰島素抵抗；并分析褪黑素對L02細(xì)胞形成胰島素抵抗的預(yù)防作用及其機(jī)制。在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以SD大鼠為研究對象，高脂飲食誘導(dǎo)形成大鼠胰島素抵抗模型，同時(shí)每天腹腔注射給予褪黑素，通過檢測血脂、血糖、血胰島素、血和肝臟中氧化及抗氧化指標(biāo)，以及鼠肝中以上多種信號蛋白、激酶的活性變化，觀察分析高脂飲食誘導(dǎo)大鼠氧化應(yīng)激和全身胰島素抵抗的關(guān)系以及褪黑素的預(yù)防作用和機(jī)制，為臨床上有效的預(yù)防

7、和治療胰島素抵抗和2型糖尿病奠定理論基礎(chǔ)和提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分：褪黑素對脂肪酸誘導(dǎo)L02細(xì)胞氧化應(yīng)激和胰島素抵抗的預(yù)防作用及機(jī)制研究
　　 目的：探討褪黑素（Melatonin，MT）對軟脂酸（Palmitic acid，PA）和亞油酸（Linoleicacid，LA）引起L02細(xì)胞氧化應(yīng)激和胰島素抵抗的預(yù)防作用及其可能機(jī)制。
　　 方法：培養(yǎng)L02細(xì)胞，分別設(shè)立對照組(BSA組)、軟脂酸組（PA組）、

8、亞油酸組（LA組）組、軟脂酸+褪黑素組（PA+MT組）、軟脂酸+維生素C組（PA+VitC組）。各組藥物濃度和孵育時(shí)間根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需要來確定。用熒光比色法測定各組細(xì)胞胞內(nèi)活性氧ROS 水平，Western-blotting 技術(shù)檢測胰島素刺激15min后胞內(nèi)胰島素信號蛋白磷酸化水平，包括Y-p-IR、Y-p-IRS1/2、p-PKB、p-GSK3β、p-FOXO1A、p-S6K 以及應(yīng)激敏感激酶p-JNK的磷酸化水平。
　　

9、結(jié)果：用不同濃度（0.1mmol/L，0.3mmol/L，0.5mmol/L）的飽和脂肪酸PA和不飽和脂肪酸LA 處理L02細(xì)胞24h，細(xì)胞內(nèi)ROS 生成量呈現(xiàn)明顯的濃度依賴關(guān)系，且0.3mmol/L和0.5mmol/L PA誘導(dǎo)生成的ROS 大于同樣濃度的LA的ROS 生成量，差異有顯著意義（P<0.05）；用0.3mmol/L的PA和LA 處理L02細(xì)胞不同時(shí)間（2h，6h，12h，24h，36h），細(xì)胞內(nèi)ROS 生成量存在明顯的時(shí)

10、間依賴關(guān)系，在24h 達(dá)到最高，并在36h后仍維持較高水平（P<0.05）；用0.3mmol/L的PA 孵育L02細(xì)胞24h，在加PA的同時(shí)分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為10μmol/L的MT和1mmol/L的維生素C（VitC），與對照BSA組相比，PA組的ROS含量明顯升高（P<0.05）；PA+MT組ROS 生成量明顯低于PA組（P<0.05）；PA+MT組與對照BSA組相比，ROS含量沒有顯著差異（P>0.05）。PA+Vit C組

11、與PA組相比，ROS的生成量減少，但仍高于PA+MT組，差異有顯著意義（P<0.05）；在BSA對照組、0.3mmol/L PA 處理組、0.3mmolPA+10umol/L MT處理組細(xì)胞培養(yǎng)24h后，PA組和PA+MT組與BSA組相比，磷酸化水平減少的有Y-p-IR、Y-p-IRS1/2、p-PKB、p-GSK3β、p-FOXO1A，磷酸化水平升高的是p-S6K和p-JNK；PA+MT組與PA組相比，使Y-p-IR、Y-p-IRS1

12、/2、p-PKB、p-GSK3β、p-FOXO1A 磷酸化水平顯著升高，明顯降低了p-S6K和p-JNK 磷酸化水平，組間均差異有顯著意義（P<0.05）。
　　 結(jié)論：游離脂肪酸導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS增加，MT 能夠清除PA 產(chǎn)生的過量的ROS。MT 通過降低活性氧，減少JNK的活化，改善胰島素信號傳遞損傷，對PA誘導(dǎo)的胰島素抵抗具有預(yù)防作用。
　　 第二部分：褪黑素對高脂飲食大鼠胰島素抵抗的預(yù)防作用及其機(jī)制研究
　　

13、 目的：研究褪黑素對高脂飲食誘導(dǎo)大鼠肝臟及全身胰島素抵抗的預(yù)防作用及其機(jī)制。
　　 方法：將230-260 克24只成年雄性Wistar 大鼠隨機(jī)分為3組，每組8只：正常組，高脂組，高脂+褪黑素組即預(yù)防組，飼養(yǎng)10 周。正常組：喂以基礎(chǔ)飼料；高脂組：喂以高脂飼料；預(yù)防組：喂以高脂飼料的同時(shí)，按0.5mg kg-1.d-1 劑量腹腔注射褪黑素，其它各組注射等量的含1%乙醇的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大鼠禁食12 小時(shí)后測量基礎(chǔ)狀態(tài)下

14、體重，進(jìn)行口服葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)，測定血清空腹胰島素、血糖、甘油三酯、總膽固醇、游離脂肪酸、高密度脂肪酸膽固醇、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平。大鼠腹腔注射胰島素（6U/kg），15min后斷頭處死，取肝臟，測定肝臟MDA含量、SOD、磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶（PEPCK）酶活性，RT-PCR檢測肝臟PEPCK、葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）mRNA水平，Western-blotting 技術(shù)檢測肝臟胰島素信號蛋白磷酸

15、化水平，包括Y-p-IR、Y-p-IRS1/2、p-PKB、p-GSK3β、p-FOXO1A、p-S6K以及應(yīng)激敏感激酶p-JNK的磷酸化水平。
　　 結(jié)果：高脂組和預(yù)防組與正常對照組比較，體重、脂體比、血胰島素、游離脂肪酸、總膽固醇、甘油三酯、胰島素抵抗指數(shù)、血和肝MDA、肝PEPCK活性和mRNA 水平、肝G-6-Pase mRNA 水平顯著升高（P<0.05），血高密度脂蛋白膽固醇、血和肝SOD水平、胰島素敏感指數(shù)明顯下降

16、（P<0.05）；預(yù)防組和高脂組比較，體重、脂體比、游離脂肪酸、總膽固醇、甘油三酯、胰島素抵抗指數(shù)、血和肝MDA、肝PEPCK活性和mRNA 水平、肝G-6-Pase mRNA 水平顯著降低（P<0.05），血高密度脂蛋白膽固醇、血和肝SOD 水平、胰島素敏感指數(shù)明顯升高（P<0.05）。高脂組和褪黑素預(yù)防組與對照組相比，肝中信號蛋白磷酸化水平明顯減少的有Y-p-IR、Y-p-IRS1/2、p-PKB、p-GSK3β、p-FOXO1A，