KLF5和hhLIM協(xié)同激活苯腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥大標(biāo)志基因表達(dá).pdf

1、目的:心肌肥大是高血壓、心臟瓣膜病、急性心肌梗塞及先天性心臟病等負(fù)荷性心臟病的并發(fā)癥,是心肌細(xì)胞對(duì)多種病理刺激的一種適應(yīng)性反應(yīng),也是導(dǎo)致頑固性心衰的主要原因。目前,導(dǎo)致心肌肥厚的病理機(jī)制尚不完全清楚。
　　 LIM蛋白是一類富含半胱氨酸且分子結(jié)構(gòu)中具有一個(gè)或多個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)家族,該家族成員廣泛參與多種細(xì)胞的發(fā)育與分化調(diào)節(jié)及多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。hhLIM又稱為hLIM3(GenBank AF121260),是用三元遞減法從人胎

2、心cDNA文庫中篩選克隆的一個(gè)與心臟生長發(fā)育有關(guān)的新基因,因其編碼產(chǎn)物與LIM蛋白家族高度同源且氨基酸序列中含有典型的LIM結(jié)構(gòu)域而得名。我們以前的研究已經(jīng)證實(shí),hhLIM是一種漿/核穿梭蛋白,在分化型細(xì)胞中,該蛋白主要分布于胞質(zhì)中,通過與α-actin相互作用,誘導(dǎo)α-actin纖絲組裝形成粗大的肌束結(jié)構(gòu),維持心肌的收縮功能。當(dāng)心肌細(xì)胞受肥大因素刺激時(shí),胞漿中的hhLIM進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),通過與Nkx2.5相互作用,協(xié)同激活BNP和α-a

3、ctin等細(xì)胞肥大相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 Krüppel樣因子(Krüppel-like factor,KLF)是一類含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子家族,主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的發(fā)育、分化、增殖和凋亡等過程。KLF家族中的KLF5(又稱BTEB2)是心血管重塑過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子,在心肌肥大過程中扮演著重要角色。
　　 雖然已經(jīng)證明hhLIM和KLF5均參與心肌肥大的發(fā)生發(fā)展過程,但二者在心肌肥大過程中的相互關(guān)系及功能聯(lián)系尚不清楚。本研

4、究探討hhLIM與KLF5在心肌肥大發(fā)生發(fā)展過程中的相互作用,為揭示心肌肥厚的發(fā)生機(jī)制提供新的研究證據(jù)。
　　 方法:用胰蛋白酶消化法分離培養(yǎng)大鼠原代心肌細(xì)胞;MTT法檢測苯腎上腺素(PE)對(duì)細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞分析術(shù)分析細(xì)胞周期各時(shí)相的分布情況;用Western blot分析檢測KLF5、hhLIM、Nkx2.5和心鈉素(ANT)表達(dá);GST pull-down和免疫共沉淀分析法檢測KLF5與hhLIM之間的相互作用;報(bào)告

5、基因分析檢測KLF5和hhLIM對(duì)ANF基因表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1)PE促進(jìn)原代心肌細(xì)胞肥大
　　 PE(20μmol/L)作用于原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞48 h后,心肌細(xì)胞體積較對(duì)照組相比明顯增大。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,PE可顯著誘導(dǎo)心肌肥大標(biāo)志基因ANF和Nkx2.5表達(dá),說明PE誘導(dǎo)心肌肥大的細(xì)胞模型復(fù)制成功。
　　 2)PE誘導(dǎo)KLF5和hhLIM表達(dá)
　　

6、 不同濃度的PE刺激心肌細(xì)胞相同時(shí)間以及相同濃度的PE作用于細(xì)胞不同時(shí)間后,KLF5和hhLIM的表達(dá)呈劑量和時(shí)間依賴性的增加。說明KLF5和hhLIM參與PE誘導(dǎo)心肌肥大的發(fā)生過程。
　　 3)KLF5與hhLIM協(xié)同激活A(yù)NF基因的表達(dá)
　　 采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將ANF啟動(dòng)子指導(dǎo)的報(bào)告基因質(zhì)粒與hhLIM/KLF5表達(dá)質(zhì)粒及內(nèi)參照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞,通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)定量分析啟動(dòng)子的活性。結(jié)果顯示,在

7、293A細(xì)胞中,單獨(dú)過表達(dá)hhLIM或KLF5,均可增強(qiáng)報(bào)告基因的表達(dá)活性,而hhLIM和KLF5表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí),報(bào)告基因的表達(dá)活性比其單獨(dú)轉(zhuǎn)染時(shí)顯著升高,熒光素酶活性達(dá)對(duì)照組的2.48倍。上述結(jié)果表明,KLF5與hhLIM可以協(xié)同激活A(yù)NT基因的表達(dá)。
　　 構(gòu)建hhLIM和KLF5腺病毒表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞,Western blot結(jié)果顯示,過表達(dá)hhLIM和KLF5可以顯著誘導(dǎo)心肌肥大標(biāo)志基因ANF的表達(dá),表明hh

8、LIM和KLF5可以協(xié)同誘導(dǎo)心肌肥大的發(fā)生。
　　 4)PE促進(jìn)KLF5與hhLIM的相互作用
　　 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,KLF5和hhLIM協(xié)同激活A(yù)NF基因的表達(dá)。為揭示二者協(xié)同作用的分子機(jī)制,我們進(jìn)行免疫共沉淀和GST pull-down實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,在PE刺激前后的原代心肌細(xì)胞和H9C2心肌細(xì)胞中,均可檢出KLF5與hhLIM相互作用,PE刺激后兩者之間的結(jié)合顯著增加,提示KLF5與hhLIM之問存在物理學(xué)上的相

9、互作用,PE能夠促進(jìn)二者之間的相互締合。
　　 5)敲低KLF5取消PE對(duì)ANF表達(dá)的誘導(dǎo)作用
　　 我們以往的實(shí)驗(yàn)證實(shí),hhLIM是一種輔轉(zhuǎn)錄因子,因此,我們推測hhIIM激活A(yù)NF表達(dá)可能是通過與KLF5相互作用實(shí)現(xiàn)的。為了證實(shí)這一推測,將大鼠KLF5特異性小干擾RNA(KLF5-siRNA)導(dǎo)入大鼠H9C2心肌細(xì)胞,敲低PE誘導(dǎo)的內(nèi)源性KLF5表達(dá)后,檢測ANF的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,KLF5-siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與