黃芩苷預(yù)處理通過抑制線粒體損傷介導(dǎo)的凋亡保護(hù)心肌缺血再灌注損傷.pdf

1、研究背景:
　　 我國冠心病發(fā)病率正逐年攀升并呈年輕化趨勢(shì)，而急性心肌梗死(Acutemyocardial infarction，AMI)是冠心病最為兇險(xiǎn)的一種類型，我國每年約百余萬患者死于AMI。因此，該病被視為“人類健康第一殺手”。
　　 隨著冠脈搭橋術(shù)、經(jīng)皮冠脈腔內(nèi)成形術(shù)等血管再通術(shù)同臻成熟，AMI的再灌注治療被廣泛開展。及時(shí)恢復(fù)冠脈血流是挽救急性缺血心肌的根本措施，但心肌在恢復(fù)血流的同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致再灌注損傷，即所謂

2、的心肌缺血-再灌注(Ischemia-Reperfusion，I-R)損傷，如何有效減輕這種損傷，使再灌注治療最大獲益成為AMI治療的最大挑戰(zhàn)。
　　 黃芩苷(baicalin)是從廣泛使用的中藥黃芩(Scutellaria baicalensis Georigi)的干燥根中提取的一種黃酮類化合物，黃芩苷是黃芩的主要生物活性成分之一，具有多重藥理作用，如抗菌、鎮(zhèn)靜、減輕炎癥反應(yīng)及較強(qiáng)的抗氧化等特性。因而，近年來被廣泛研究。黃芩苷

3、多種病理生理?xiàng)l件下被廣泛研究，最近有研究報(bào)道黃芩苷預(yù)處理能有效減輕肝臟及腦組織的I-R損傷。在一些體外研究中，黃芩苷及其苷元黃芩素被報(bào)道具有保護(hù)心肌損傷的作用。最近，一項(xiàng)體外研究報(bào)道:黃芩苷預(yù)處理可通過抗炎機(jī)制緩解培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡。Tu IH等也報(bào)道黃芩苷能減少缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。然而，黃芩苷在缺血性心臟疾病中的在體研究較少。Peng及其同事近期研究證實(shí):口服黃芩苷預(yù)處理能通過抗氧化機(jī)制有效保護(hù)心肌缺血性損傷。然而，

4、黃芩苷對(duì)心肌缺血再灌注損傷的體內(nèi)研究及相關(guān)機(jī)制未見報(bào)道。
　　 研究證實(shí)氧自由基過度形成及鈣超載是導(dǎo)致心肌I-R損傷的主要因素。持續(xù)的心肌缺血及缺血后心肌再灌注均可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，盡管再灌注可減少凋亡心肌細(xì)胞數(shù)，但卻使不可逆轉(zhuǎn)的心肌細(xì)胞加速凋亡。這是由于再灌注早期ROS爆發(fā)，在這種氧化應(yīng)激條件下，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔大量開放，線粒體功能障礙可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。我們提出假說:黃芩苷預(yù)處理通過抑制線粒體損傷介導(dǎo)的凋亡保護(hù)心肌缺血再灌注損

5、傷。
　　 目的:
　　 1.建立小鼠心肌缺血再灌注損傷模型，在動(dòng)物體內(nèi)水平證實(shí)黃芩苷預(yù)處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷的作用;
　　 2.探索黃芩苷能否通過減輕線粒體損傷介導(dǎo)的凋亡保護(hù)心肌缺血再灌注損傷。
　　 對(duì)象和方法:
　　 第一部體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　 本實(shí)驗(yàn)選用野生型小鼠（8至10周齡，體重25至28g的雄性C57 BL/6小鼠），結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支45分鐘后解除結(jié)扎線2小時(shí)，構(gòu)建小鼠心肌缺

6、血再灌注損傷模型。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)對(duì)象被分成5組:假手術(shù)組、Vehicle（生理鹽水）+缺血再灌注（I/R）組;黃芩苷(50 mg/kg)+I/R組;黃芩苷(100 mg/kg)+I/R組;黃芩苷(200 mg/kg)+I/R組，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、分組情況及相應(yīng)結(jié)果見“本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果”部分。確定最佳藥物劑量（100 mg/kg）后，小鼠被隨機(jī)分成3組:假手術(shù)組、Vehicle（生理鹽水）+缺血再灌注(I/R)組;黃芩苷(100 mg/kg

7、)+I/R組。黃芩苷或生理鹽水于冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎前10分鐘經(jīng)靜脈輸注。（備注:心肌梗死指標(biāo)中每組n=8;左室功能測(cè)定每組n=7;檢測(cè)凋亡及免疫組化分析時(shí)每組n=6;線粒體損傷分析每組n=4;抗氧化檢測(cè)每組n=5;蛋白免疫分析每組n=3）。
　　 第二部體外實(shí)驗(yàn)
　　 建立心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，模擬心肌缺血再灌注過程。乳鼠原代心肌細(xì)胞分離和培養(yǎng):采用胰酶/膠原酶消化法。分為對(duì)照組（常氧組），vehicle+缺氧/復(fù)氧

8、組和Baicalin+缺氧/復(fù)氧組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。觀察心肌細(xì)胞搏動(dòng)和形態(tài)學(xué)變化，CCK8法檢測(cè)心肌細(xì)胞活力;TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡水平;試劑盒檢測(cè)LDH及SOD表達(dá)水平。
　　 所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均采用SPSS13.0專業(yè)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)值均被表達(dá)為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）。對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊，則組間比較用方差分析，兩兩比較用最小顯著差異法(least significant dif

9、ference，LSD)方法;當(dāng)方差不齊時(shí)，組間比較采用Welch法進(jìn)行近似方差分析，兩兩比較用Dunnett's T3。P＜0.05被認(rèn)為數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 (1)黃芩苷預(yù)處理減少再灌注后心肌梗死面積。AAR/LVd在各組間經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)方差不齊(P=0.001)，采用Welch法進(jìn)行近似方差分析。AAR/LV比值在vehicle組和黃芩苷組(

10、100 mg/kg)幾乎相等，表明心肌缺血范圍在這兩組間相似(P=0.425)。INF/AAR經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差不齊（P=0.006），采用Welch法進(jìn)行近似方差分析。黃芩苷預(yù)處理組INF/AAR(INF:infarct size)和INF/LV顯著降低（F=203.818，P＜0.001 vs.vehicle組）。vehicle組和黃芩苷預(yù)處理組，INF/AAR的平均比率分別為47.750±5.481％及21.088±

11、5.874％。
　　 (2)黃芩苷預(yù)處理改善心肌I-R后左室功能。左室舒張術(shù)內(nèi)徑LVEDD在各組間經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)方差齊(P=0.667);LVESD方差不齊（P=0.044）LVFS方差不齊（P=0.001）。左室舒張末內(nèi)徑LVEDD在各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.129，P=0.880)。左室收縮末內(nèi)徑(LVESD)、LVFS各組問差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Welch=315.394，P＜0.001;Welch=2

12、042.669，P＜0.001)。黃芩苷預(yù)處理后LVESD同vehicle組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。黃芩苷預(yù)處理同vehicle組相比左室短軸縮短率(LVFS)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　 (3)黃芩苷預(yù)處理抑制I-R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。TUNEL經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差不齊（P＜0.001），采用Welch法進(jìn)行近似方差分析。黃芩苷預(yù)處理同vehicle組相比心臟組織中TUNEL陽性細(xì)胞核

13、數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001，每組4只小鼠，每只小鼠心臟分別計(jì)數(shù)10個(gè)視野，n=40);免疫組化分析顯示黃芩苷組cleaved caspase-3表達(dá)較vehicle組減少（n=3每組）;Westernblot分析Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差齊(P=0.094)，采用LSD進(jìn)行組間多重比較。Western blot分析顯示黃芩苷預(yù)處理同Vehicle組相比，caspase-3活性降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.011，n=3

14、每組）。
　　 (4)黃芩苷預(yù)處理對(duì)心肌I-R過程中線粒體形態(tài)的作用。缺血區(qū)線粒體明顯腫脹，表現(xiàn)為面積增大，部分線粒體脊消失，而非缺血區(qū)域線粒體結(jié)構(gòu)致密;正常線粒體可見電子致密的基質(zhì)和未破壞的線粒體脊，心肌I-R損傷后，損傷的線粒體可見部分線粒體脊斷裂，線粒體基質(zhì)腫脹，黃芩苷預(yù)處理能改善線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷。
　　 (5)黃芩苷預(yù)處理減輕心肌I-R后線粒體腫脹和線粒體分裂。平均線粒體面積經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差齊(

15、P=0.378)，采用LSD進(jìn)行組間多重比較。黃芩苷預(yù)處理減輕心肌I-R后平均線粒體面積（P＜0.01 vs.vehicle組，每組4只，每只觀察10個(gè)視野，n=40）;線粒體分裂百分比經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差不齊(P＜0.018)，采用Welch法進(jìn)行近似方差分析。黃芩苷預(yù)處理減少線粒體分裂百分比（P＜0.001 vs.vehicle組，每組4只，每只觀察5個(gè)視野，n=20）。
　　 (6)黃芩苷預(yù)處理減少心肌I-R后

16、線粒體基質(zhì)微粒和線粒體周脂滴數(shù)。線粒體基質(zhì)微粒數(shù)經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差不齊(P＜0.001)，采用Welch法進(jìn)行近似方差分析。黃芩苷預(yù)處理減少心肌I-R后線粒體基質(zhì)微粒數(shù)(P＜0.001 vs.vehicle組，n=40每組);線粒體周脂滴數(shù)經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差不齊(P=0.042)，采用Welch法進(jìn)行近似方差分析。黃芩苷預(yù)處理減少線粒體周脂滴數(shù)（P＜0.001 vs.vehicle組，n=20每組）。

17、　　 (7)黃芩苷預(yù)處理在心肌I-R過程中發(fā)揮抗氧化作用。Mn-SOD活性經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差齊（P=0.432），采用LSD進(jìn)行組間多重比較。黃芩苷預(yù)處理增強(qiáng)心肌中Mn-SOD活性（P＜0.001 vs.vehicle組）;CAT活性經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差齊(P=0.894)，采用LSD進(jìn)行組間多重比較。黃芩苷預(yù)處理增加心肌中CAT活性（P=0.018 vs.vehicle組）;經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差

18、不齊(P=0.002)，采用Welch法進(jìn)行近似方差分析。黃芩苷預(yù)處理降低ROS活性（P=0.003 vs.vehicle組，n=5每組）。
　　 (8)黃芩苷預(yù)處理通過靶向PKC beta2保護(hù)心肌I-R損傷。免疫組化染色顯示黃芩苷預(yù)處理組心肌中PKC beta2表達(dá)下調(diào)（n=6心臟/組）;經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差不齊(P=0.022)，采用Welch法進(jìn)行近似方差分析。Western blot分析顯示黃芩苷預(yù)處理組P

19、KC beta2表達(dá)水平降低，同vehicle組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.044，n=3每組）;
　　 本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果:
　　 (1)黃芩苷預(yù)處理減少心肌梗死面積:vehicle或黃芩苷處理的心臟的AAR/LV比值相當(dāng);INF/AAR經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差不齊（P=0.019），采用Welch法進(jìn)行近似方差分析。不同劑量的黃芩苷均可減少心肌I-R后心梗面積(50、100或200 mg/kg)，黃芩苷

20、(100 mg/kg)(26.483±3.224)較50 mg/kg(39.083±3.596)具有更強(qiáng)的限制梗死面積的作用(P=0.001)，而200 mg/kg的劑量同100 mg/kg劑量相比無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=1.000，n=6每組）。
　　 (2)黃芩苷預(yù)處理減少心肌I-R損傷后細(xì)胞凋亡及LDH水平。TUNEL陽性細(xì)胞比率經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差齊（P＜0.001），采用LSD進(jìn)行組間多重比較。不同劑量黃芩苷

21、預(yù)處理均可降低TUNEL陽性細(xì)胞比率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，n=30每組）;LDH水平經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差齊(P=0.813)，采用LSD進(jìn)行組間多重比較。黃芩苷預(yù)處理降低再灌注2h后血漿LDH水平，(P＜0.001，n=8每組)。
　　 (3)黃芩苷預(yù)處理增加再灌注2h后Bcl-2/Bax比值。Bax免疫組化染色結(jié)果，黃芩苷組較vehicle組Bax表達(dá)降低; Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)Western

22、blot分析結(jié)果經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差齊（Bax: P=0.192; Bcl-2:P=0.197），采用LSD進(jìn)行組間多重比較。黃芩苷預(yù)處理降低Bax蛋白表達(dá)，同Vehicle組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001); Bcl-2免疫組化染色結(jié)果，黃芩苷組較vehicle組Bcl-2表達(dá)增加，同Vehicle組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001); Western blot分析顯示黃芩苷預(yù)處理顯著增加Bcl-2蛋白表達(dá);Bc

23、l-2/Bax比值經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差齊（P=0.202），采用LSD進(jìn)行組間多重比較。黃芩苷預(yù)處理增加心肌再灌注2h后Bcl-2/Bax比值(P＜0.001 vs.vehicle組，n=3每組)。
　　 (4)黃芩苷預(yù)處理抑制心肌重構(gòu)。纖維化面積經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差不齊（P=0.018），采用Welch法進(jìn)行近似方差分析。黃芩苷預(yù)處理顯著降低心臟纖維化面積(P＜0.001 vs.vehicle組，n=7

24、每組);心重/體重比經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差齊(P=0.070)，采用LSD進(jìn)行組間多重比較。黃芩苷預(yù)處理減少心重/體重比（heart/body weight ratio）（P＜0.001 vs.vehicle組，n=6每組）;橫截面積經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差不齊(P＜0.001)，采用Welch法進(jìn)行近似方差分析。黃芩苷預(yù)處理降低心肌細(xì)胞橫截面積（P＜0.001 vs.vehicle組，n=20每組）。
　　

25、2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 (1)胰酶/膠原酶連續(xù)消化法成功獲取SD乳鼠原代心肌細(xì)胞:
　　 胰酶/膠原酶連續(xù)多次消化獲得的細(xì)胞懸液接種后12h，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)樗笮位虿灰?guī)則扁平狀，24h后即可看到單個(gè)細(xì)胞的自發(fā)收縮，繼而細(xì)胞逐漸鋪展伸出偽足，形成不規(guī)則的星形，到第4～5天，細(xì)胞相互接觸交織成網(wǎng)，形成細(xì)胞簇貼壁，按照相同的頻率收縮。
　　 (2)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的評(píng)估
　　 本部分實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次(n=5)，采

26、用One-Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。細(xì)胞凋亡率經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差齊（P=0.054），采用LSD進(jìn)行組間多重比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為0.046±0.011，缺氧組細(xì)胞凋亡率為0.468±0.039，缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞凋亡率為0.722±0.065。缺氧時(shí)心肌細(xì)胞凋亡率較正常組增加(P＜0.001)，恢復(fù)氧氣供應(yīng)后，細(xì)胞凋亡率不降反升(P＜0.001)，說明心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型成功。此外，我們?cè)u(píng)估了黃芩苷預(yù)處

27、理對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞凋亡率的影響，結(jié)果顯示黃芩苷預(yù)處理組細(xì)胞凋亡率為0.616±0.036，較缺氧/復(fù)氧組降低(P=0.001)。
　　 (3)黃芩苷預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞活性的影響
　　 本部分實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次(n=5)，經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差不齊（P=0.029），采用Welch法進(jìn)行近似方差分析。心肌細(xì)胞缺氧后活性顯著降低，為41.840±1.412（P＜0.001 vs.Control

28、組），而復(fù)氧后心肌細(xì)胞活性增加，為64.760±3.371(P＜0.001 vs.Hypoxia組)，我們進(jìn)一步檢測(cè)了黃芩苷預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞活性的影響，結(jié)果顯示黃芩苷組細(xì)胞活性為70.660±3.746，因此，黃芩苷可增加心肌細(xì)胞活性(P＜0.001 vs.H/R組)。
　　 (4)黃芩苷預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧時(shí)SOD水平的作用
　　 本部分實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次(n=5)，經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差齊（P=0.137）

29、，采用LSD進(jìn)行組間多重比較。心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后SOD水平顯著降低，為105.100±5.001(P＜0.001 vs.Control組)，我們進(jìn)一步檢測(cè)了黃芩苷預(yù)處理對(duì)SOD活性的影響，結(jié)果顯示黃芩苷組SOD活性為122.600±6.006，因此，黃芩苷可增加心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后SOD活性(P＜0.001 vs.H/R組)。
　　 (5)黃芩苷預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧時(shí)LDH水平的作用
　　 本部分實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次(n

30、=5)，經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，方差齊(P=0.267)，采用LSD進(jìn)行組間多重比較。心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后LDH水平升高，為26.800±0.809（P＜0.001 vs.Control組），我們進(jìn)一步檢測(cè)了黃芩苷預(yù)處理對(duì)LDH活性的影響，結(jié)果顯示黃芩苷組LDH活性為22.200±1.666，因此，黃芩苷可降低心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后LDH水平，同H/R組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。
　　 結(jié)論:
　　 這些