肝炎病毒檢測條件的優(yōu)化及藻膽蛋白相互作用研究.pdf

1、第一部分:病毒性肝炎是對人類健康危害嚴(yán)重的傳染病之一。由于HBV和HCV混合感染不僅是原發(fā)性肝癌發(fā)生的原因，也是導(dǎo)致肝組織纖維變，加快向肝硬化發(fā)展的重要因素。所以研究HBV、HCV的病理機制為臨床早期抗病毒干預(yù)治療，控制肝組織纖維化進程，提供了理論依據(jù)，對肝癌防治具有重要意義。
　　 一般對HBV和HCV檢測有免疫學(xué)方法和核酸檢測法，免疫學(xué)方法主要包括放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)、酶免技術(shù)分析（ELISA）、時間分辨熒光免疫分析（TR

2、FIA）和化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）等；核酸檢測方法主要有斑點雜交技術(shù)和PCR技術(shù)，其中PCR技術(shù)檢測存在假陽性和假陰性的情況，本實驗通過優(yōu)化PCR的檢測條件達到快速靈敏檢測，降低假陽性和假陰性的目的。
　　 本實驗用已經(jīng)構(gòu)建好的pGEM-T-HBV（C區(qū)/C基因）和pGEM-T-HCV（核心蛋白）作為PCR檢測的質(zhì)粒模板，通過改變Mg2+濃度、退火溫度以及采用不同的酶進行PCR檢測條件的優(yōu)化。其中檢測HBV病毒時共設(shè)了1.5

3、μl-4.0μl共6個Mg2+濃度梯度，設(shè)了58.0~62.0℃共12個溫度梯度，質(zhì)粒模板稀釋濃度從10-1-10-9共9個濃度梯度。檢測HCV病毒時，共設(shè)了1.5~2.0μl共6個Mg2+濃度梯度，設(shè)了56.0~60.0℃共12個溫度梯度，質(zhì)粒模板稀釋濃度從10-1~10-9共9個濃度梯度。實驗結(jié)果證明檢測HBV病毒時，4.0μl為最佳Mg2+濃度，59℃為最佳退火溫度，天源公司的Taq DNA聚合酶靈敏性最高，對質(zhì)粒濃度的要求達到1

4、0-9。當(dāng)檢測HCV病毒時，1.5μl為最佳Mg2+濃度，57℃為最佳退火溫度，Bio-Rad公司的iTaq聚合酶靈敏性最高，對質(zhì)粒濃度的要求達到10-6。
　　 第二部分:藻膽體(phycobilisome)是存在于藍藻和紅藻中的一類捕光蛋白復(fù)合物，它由藻膽蛋白（phycobiliprotein）和連接蛋白組成。藻膽蛋白由藻膽色素（phycobilin）與相應(yīng)的脫輔基蛋白中保守性半胱氨酸的巰基以硫醚鍵共價結(jié)合而成。藻膽蛋白是一

5、類結(jié)構(gòu)相似的色素蛋白。目前已發(fā)現(xiàn)了一種能催化β-CPC84、β-PEC84、α-APC82和β-APC82位半胱氨酸殘基與PCB連接的裂合酶基因cpeS，其編號為alr0617。為了研究PCB與層理鞭枝藻藻紅藍蛋白連接的機制β亞基（β-PEC）第84位Cys連接機制，現(xiàn)通過同源性分析，篩選出四個同源性較高的基因片段，即alr0617，all5339， all5292，alr0647?，F(xiàn)根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)，將編號為alr0617，all5339

6、，all5292，alr0647基因編碼的蛋白命名為CpeS1，CpeT1，CpeS2，CpeT2, CpeT1能分別與CpeT2、CpeS1、PecE形成比較明顯的復(fù)合物，但是只有CpeT1與CpeT2之間形成大約1：1的復(fù)合物。
　　 本研究成功構(gòu)建質(zhì)粒pBT- CpeS1、pBT- CpeS2、pBT- CpeT2、pBT- 3357、pTRG- CpeS1、pTRG- CpeT1、、pTRG- 3357基因。
　　

7、 將pBT- CpeS1、pBT- CpeS2、、pBT- CpeT2、pBT- 3357和pTRG- CpeT1；pBT- CpeS1、pBT- CpeS2、pBT- CpeT2和pTRG- 3357；pBT- CpeS2、、pBT- CpeT2和pTRG- CpeS1共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，利用細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)，證明pBT- CpeT2、pBT-CpeS2、pBT-CpeS1和pBT-3357的重組子 與pTRG-CpeT1的重組子有相互作