熱療協(xié)同順鉑對體外胃癌MGC-803細(xì)胞增殖抑制作用及其機制的研究.pdf

1、目的:順鉑(Cisplatin,DDP)是一種高效廣譜的抗癌藥,其療效呈劑量相關(guān)性,但大劑量可以引起不可逆性腎功能損害及嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng),從而限制了臨床應(yīng)用及療效的進(jìn)一步提高。熱療(Hyperthermia)除了能夠直接殺傷癌細(xì)胞外,還具有化療增敏作用,兩者結(jié)合可以顯著提高抗腫瘤效果。本研究通過體外試驗探討熱療聯(lián)合順鉑對胃癌MGC-803細(xì)胞增殖抑制作用,并對可能存在的機制進(jìn)行初步的探討,從而為熱療在臨床上的應(yīng)用提供了有力的依據(jù)。

2、>　　 方法:1體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株MGC-803,應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)(tetrzolium-based colorimetric assay,MTT)法測定不同的順鉑濃度組(0.625、1.25、2.5、5、10、20μg/mL)細(xì)胞的增殖抑制率,確定順鉑的工作濃度,并以該濃度進(jìn)行實驗。2 MTT法測定對照組和低、中、高順鉑濃度組(1.5、7、12μg/mL)及其對應(yīng)的熱化療組細(xì)胞的存活率,根據(jù)Weeb系數(shù)判斷熱化療聯(lián)合是否有協(xié)同效

3、應(yīng)。3隨機分為四個實驗組:對照組、熱療組、化療(DDP)組、熱化療組,選擇順鉑培養(yǎng)24h后、細(xì)胞生長抑制率達(dá)30％的藥物濃度作為實驗的工作濃度。流式細(xì)胞儀(flowcytometry,FCM)檢測各組處理后細(xì)胞周期的分布。4分別提取各組細(xì)胞總RNA,鑒定其完整性及含量,通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverstranscription PCR,RT-PCR)半定量檢測不同因素處理后胃癌MGC-803細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1

4、)mRNA、增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcell nuclear antigen,PCNA)mRNA的表達(dá)水平。5采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組處理后胃癌MGC-803細(xì)胞中CyclinD1、PCNA蛋白的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:1 MTT結(jié)果顯示:在一定的濃度范圍內(nèi),不同濃度的DDP對MGC-803細(xì)胞作用24小時后,其劑量-效應(yīng)呈線性相關(guān),線性相關(guān)分析抑制率與藥物濃度呈正相關(guān)(r=0.8551,P=0.0300),直線

5、回歸分析求出DDP濃度(x)與抑制率(y)的回歸方程y=0.1801+0.0444x,選擇培養(yǎng)24h后、細(xì)胞生長抑制率達(dá)30％的藥物濃度作為實驗的工作濃度,計算DDP的實驗為2.7μg/ml。2 MTT結(jié)果顯示:隨著順鉑濃度的升高,化療組及熱化療組細(xì)胞存活率逐漸降低,且熱化療組細(xì)胞存活率與化療組細(xì)胞存活率相比顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。采用Weeb系數(shù)分別判定熱化療聯(lián)合的相互作用,Weeb分析的結(jié)果表明低、中、高濃度的D

6、DP分別聯(lián)合熱療對MGC-803細(xì)胞的增殖抑制作用具有協(xié)同效應(yīng)。3流式細(xì)胞儀檢測胃癌MGC-803細(xì)胞周期分布顯示,熱療組:與對照組相比,G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高,S期細(xì)胞比例顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)?；熃M:與對照組相比,S期比例顯著降低,G0/G1期、G2/M期細(xì)胞比例顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。熱化療組:與其它三組相比,S期細(xì)胞比例顯著降低,G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜

7、0.05)。4 RT-PCR檢測結(jié)果顯示:CyclinD1:與對照組相比,熱療組、化療組及熱化療組聯(lián)合均可使CyclinD1mRNA表達(dá)量顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),熱化療組與熱療組或化療組相比,CyclinD1mRNA表達(dá)量顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。PCNA:熱療組、化療組、熱化療組和對照組比較,均可使PCNAmRNA表達(dá)量顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),熱化療組與熱療組或化療組相比,PC

8、NAmRNA表達(dá)量顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。5流式細(xì)胞術(shù)檢測CyclinD1、PCNA蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示:CyclinD1蛋白:與對照組相比,熱療組、化療組及熱化療組聯(lián)合均可使CyclinD1蛋白表達(dá)量顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),熱化療組與熱療組或化療組相比,CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。PCNA蛋白:熱療組、化療組、熱化療組和對照組比較,均可使PCNA蛋白表達(dá)量

9、顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),熱化療組與熱療組或化療組相比,PCNA蛋白表達(dá)量顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1低、中、高濃度的DDP分別聯(lián)合熱療對MGC-803細(xì)胞的增殖抑制作用具有協(xié)同效應(yīng)。
　　 2熱化療聯(lián)合使細(xì)胞周期的分布發(fā)生改變,減少了增殖細(xì)胞在S期的分布,阻斷細(xì)胞在S期的DNA合成,影響了細(xì)胞周期的正常運行,使細(xì)胞生長變慢,甚至凋亡。
　　 3熱