羊膜制備工藝的研究以及改良.pdf

1、目的：
　　 通過(guò)對(duì)現(xiàn)有羊膜制備工藝進(jìn)行研究比較，分別從滅菌、保存條件以及對(duì)傳統(tǒng)羊膜貼載物改進(jìn)這幾個(gè)方面入手，以期尋找出一種對(duì)羊膜損傷小，便于制備，易于保存，更加方便臨床使用且易推廣的方法。
　　 本實(shí)驗(yàn)共分為三部分：
　　 實(shí)驗(yàn)一：檢測(cè)常用滅菌方式對(duì)羊膜上皮性狀影響
　　 實(shí)驗(yàn)二：探討不同保存條件對(duì)羊膜性狀的影響
　　 實(shí)驗(yàn)三：將無(wú)紡材料（聚丙烯無(wú)紡布，Polypropylene Non-wov

2、en Substrates）作為新型羊膜貼載物的研究
　　 方法：
　　 實(shí)驗(yàn)一：取健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦胎盤羊膜，隨機(jī)分為四組，分別以抗菌素（含青霉素10，00U/ml，慶大霉素10，00U/ml、二性霉素B2.5μg/ml）、過(guò)氧乙酸/乙醇混合液（過(guò)氧乙酸12.5ml，96％乙醇125ml，蒸餾水362.5ml）、γ-射線、0.5％碘伏滅菌，行病原學(xué)檢測(cè)確認(rèn)達(dá)到臨床運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)后，HE染色觀察羊膜上皮細(xì)胞形態(tài)變化；免疫熒光、RT

3、-PCR檢測(cè)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）及其mRNA的表達(dá)，并設(shè)未經(jīng)任何滅菌處理的羊膜作為對(duì)照。
　　 實(shí)驗(yàn)二：將按常規(guī)方法制備好的羊膜隨機(jī)分為三組，分別于4℃，-20℃以及-80℃保存1月，3月，6月后，分別行光鏡以及電鏡觀察，比較不同保存組之間羊膜上皮細(xì)胞以及基質(zhì)的變化，評(píng)估不同保存條件對(duì)羊膜的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)三：用新型無(wú)紡布替代硝酸纖維濾膜作為羊膜貼載物，探討羊膜與無(wú)紡布的不

4、同貼載模式，并將羊膜分別貼載于硝酸纖維濾膜、無(wú)紡布后各置于純甘油-80℃保存1個(gè)月，行HE染色、透射電鏡檢測(cè)，觀察羊膜上皮細(xì)胞以及基質(zhì)的形態(tài)。
　　 結(jié)果：
　　 實(shí)驗(yàn)一：所采用的幾種滅菌方法病原學(xué)培養(yǎng)結(jié)果均為陰性，經(jīng)過(guò)氧乙酸/乙醇混合液和抗菌藥處理的羊膜細(xì)胞形態(tài)完好，而經(jīng)γ-射線處理的細(xì)胞形態(tài)損害較大。經(jīng)滅菌處理后，羊膜細(xì)胞的HGF和TIMP-1蛋白表達(dá)均有所下降（P<0.05），由高到低依次為PES組、抗菌藥組、碘伏

5、組和γ-射線組；HGF和TIMP-1的mRNA表達(dá)也有下降（P<0.05），其中γ-射線處理組下降趨勢(shì)更明顯（P<0.05），其余3個(gè)處理組間無(wú)明顯差別（P>0.05）。
　　 實(shí)驗(yàn)二：經(jīng)4℃保存的羊膜隨著時(shí)間的延長(zhǎng)羊膜上皮細(xì)胞破壞加重，在保存到3個(gè)月的時(shí)候，羊膜上皮細(xì)胞丟失較為嚴(yán)重。經(jīng)-20℃和一80℃保存的羊膜上皮細(xì)胞隨保存時(shí)間延長(zhǎng)也出現(xiàn)破壞，但損害程度較小，且保存3個(gè)月與保存6個(gè)月相比較無(wú)明顯差異。在相同時(shí)間點(diǎn)上，-20℃

6、保存的羊膜與-80℃保存的羊膜相比較，上皮細(xì)胞有差異但不顯著，遠(yuǎn)優(yōu)于4℃保存。另外，羊膜基質(zhì)在4℃保存6個(gè)月后發(fā)生變化，膠原纖維減少，而-20℃和-80℃保存的羊膜基質(zhì)無(wú)明顯變化。
　　 實(shí)驗(yàn)三：與傳統(tǒng)的硝酸纖維濾膜相比較，無(wú)紡布作為羊膜貼載物更具優(yōu)勢(shì)：其擁有良好韌性，經(jīng)折疊不易變型；保存時(shí)兩者可緊密貼合不分開；臨床使用時(shí)與羊膜易于辨別，在生理鹽水中復(fù)水較短時(shí)間即可將其兩者分開；形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的硝酸纖維濾膜相比較，無(wú)紡布對(duì)

7、羊膜上皮細(xì)胞以及基質(zhì)形態(tài)無(wú)明顯影響。
　　 結(jié)論：
　　 1、就現(xiàn)行常用的滅菌方式抗菌素浸泡、過(guò)氧乙酸/乙醇混合液浸泡、γ-射線照射、碘伏浸泡而言，過(guò)氧乙酸/乙醇混合液浸泡對(duì)羊膜的損傷最小，值得進(jìn)一步研究。
　　 2、相對(duì)于其他保存溫度而言，-20℃能較好的維持羊膜的形態(tài)，且該溫度是現(xiàn)有普通家用冰箱都達(dá)到的條件，故該法可大范圍推廣，特別是適用于經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)的應(yīng)用。
　　 3、無(wú)紡布作為羊膜貼載物比硝酸纖