TGF-β1誘導(dǎo)人口腔鱗癌細(xì)胞中整合素β6表達(dá)的分子機(jī)制.pdf

1、研究目的：
　　轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）是一種具有多種生物功能的細(xì)胞因子，與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)的整合素avβ6在口腔鱗癌細(xì)胞中都異常高表達(dá)．而整合素avβ6的表達(dá)受關(guān)鍵性亞單位整合素β6(ITGB6)調(diào)控?；虻霓D(zhuǎn)錄調(diào)控與基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合狀態(tài)及組蛋白乙?；揎椕芮邢嚓P(guān)。本研究擬通過研究β6基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子的活化狀態(tài)及組蛋白乙酰化修飾狀態(tài)，研究TGF-β1調(diào)控β6表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步探究整合素avβ6在

2、口腔鱗癌中過度表達(dá)的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　材料和方法：
　　用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人口腔鱗癌細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR以及Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TGF-β1對(duì)β6表達(dá)的影響；利用mRNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TGF-β1對(duì)β6的轉(zhuǎn)錄水平的影響是否與mRNA的穩(wěn)定性有關(guān)；進(jìn)一步利用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)β6基因啟動(dòng)子中TGF-β1主要應(yīng)答區(qū)；利用生物信息學(xué)方法并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)預(yù)測(cè)調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞TGF-β

3、1誘導(dǎo)的β6基因轉(zhuǎn)錄活性的可能順式作用元件及與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子；利用定點(diǎn)突變和染色質(zhì)免疫共沉淀方法確定調(diào)控口腔鱗癌細(xì)胞TGF-β1誘導(dǎo)的β6基因轉(zhuǎn)錄活性的主要順式作用元件及與之結(jié)合的反式作用因子；染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)檢測(cè)TGF-β1誘導(dǎo)的β6啟動(dòng)子區(qū)組蛋白乙?；揭约耙阴；D(zhuǎn)移酶在此區(qū)域的結(jié)合水平。
　　結(jié)果：
　　1. TGF-β1上調(diào)口腔鱗癌細(xì)胞整合素β6 mRNA和蛋白表達(dá)．mRNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)證明TGF-β1不能增強(qiáng)β

4、6 mRNA的穩(wěn)定性而上調(diào)β6轉(zhuǎn)錄水平。
　　2.整合素β65’側(cè)翼區(qū)熒光素梅報(bào)告基因質(zhì)粒pGL2-B6（-3/+208）、pGL2-B6（-150/+208）、pGL2-B6（-421/+208）分別轉(zhuǎn)染SAS細(xì)胞，分析TGF-β1對(duì)其影響，整合素β6啟動(dòng)子區(qū)-150~-421 nt是TGF-β1的主要應(yīng)答區(qū)，結(jié)合生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)到改區(qū)域主要轉(zhuǎn)錄因子有AP-1、C/EBP、SRF，c-Myb對(duì)AP-1、C/EBP、SRF、c-

5、Myb結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，結(jié)果顯示，AP-1、C/EBP、SRF的潛在結(jié)合位點(diǎn)可能涉及TGF-β1誘導(dǎo)的β6轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)一步用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（ChIP）發(fā)現(xiàn)，TGF-β1促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子JunB、C/EBPα、SRF在口腔鱗癌細(xì)胞中與β6基因啟動(dòng)子區(qū)-150~-421 nt結(jié)合增加，同時(shí)Western blotting結(jié)果顯示，TGF-β1促進(jìn)JunB、C/EBPα和SRF蛋白表達(dá)。
　　3.染色質(zhì)免疫沉淀檢測(cè)到TGF-β1誘導(dǎo)

6、的β6啟動(dòng)子區(qū)-150~-421 nt的乙?；揭约敖M蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶CBP結(jié)合量升高，其中組蛋白H3乙?；皆赥GF-β1作用2h時(shí)達(dá)到最高，組蛋白H4乙?；胶虲BP結(jié)合量則在0.5h時(shí)達(dá)到最高。當(dāng)用siRNA使CBP基因表達(dá)靶向沉默后，TGF-β1誘導(dǎo)的β6 mRNA以及蛋白水平顯著降低。使用去乙?；敢种苿㎜BH589（10μM）、SAHA(1μM)作用于SAS細(xì)胞，能使TGF-β1誘導(dǎo)的β6 mRNA以及蛋白表達(dá)水平升高

7、。
　　結(jié)論：
　　1. TGF-β1誘導(dǎo)整合素β6 mRNA以及蛋白表達(dá)水平上調(diào)，轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是關(guān)鍵。
　　2.整合素β6啟動(dòng)子區(qū)對(duì)TGF-β1的主要應(yīng)答區(qū)位于-150~-421 nt，TGF-β1使此區(qū)域的反式作用因子AP-1亞單位JunB，C/EBPα，SRF結(jié)合增多從而使整合素β6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活化
　　3.整合素β6啟動(dòng)子區(qū)-150~-421 nt組蛋白乙?；缴邊⑴cTGF-β1誘導(dǎo)的整合素β6轉(zhuǎn)錄活化