清熱解毒與滋陰清熱、活血化瘀對(duì)T2DM PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響的比較研究.pdf

1、目的：本課題在前期畿白草能有效降血糖、保護(hù)胰島B細(xì)胞的研究基礎(chǔ)上，結(jié)合中醫(yī)辯證論治的思維原則、中醫(yī)對(duì)DM病因病機(jī)和病程演變的理解，擬對(duì)清熱解毒、滋陰清熱、活血化瘀對(duì)T2DM及其血管病變，對(duì)骨骼艦細(xì)胞胰島素PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響進(jìn)行比較研究，分別選用翻白草、生地、丹參代襲清熱解毒、滋陰清熱、活血化淤。觀(guān)測(cè)清熱解毒與滋陰清熱、活血化淤對(duì)T2DM大鼠糖代謝影響的比較；對(duì)T2DM大鼠血清NO和ET影響的比較；對(duì)T2DM大鼠腹主動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)影響的

2、比較；對(duì)T2DM犬鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)影響的比較；對(duì)T2DM大鼠骨骼肌PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)上的影響．旨在從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的角度探索清熱解毒、滋陰清熱、活血化瘀防治DM及其并發(fā)癥的實(shí)質(zhì)，探討熱毒在DM及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的地位，為中醫(yī)藥防治DM的研究提供新思路。 方法： 1、理論研究：對(duì)DM的流行病學(xué)、病因及發(fā)病機(jī)制、分型及診斷、治療以及其并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制等進(jìn)行系統(tǒng)文獻(xiàn)復(fù)習(xí)研究，查閱近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究文獻(xiàn)資料，對(duì)資料進(jìn)行較為系

3、統(tǒng)的總結(jié)和綜述，掌握相關(guān)研究項(xiàng)目和指標(biāo)的科研前沿動(dòng)態(tài)。對(duì)傳統(tǒng)中醫(yī)理論關(guān)于DM病因病機(jī)、辨證論治、治法、方藥的文獻(xiàn)進(jìn)行系統(tǒng)復(fù)習(xí)研究，查閱近年來(lái)中醫(yī)學(xué)的相關(guān)研究文獻(xiàn)資料，對(duì)資料進(jìn)行較為系統(tǒng)的總結(jié)和綜述，掌握相關(guān)文獻(xiàn)資料的研究成果和研究動(dòng)態(tài)。 2、實(shí)驗(yàn)研究： (1)Wistar大鼠84只，隨機(jī)選取7只為正常組；其余77只予以高熱量高糖高脂飲食加鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射造模，造模成功后隨機(jī)分為模型組、格列奇特組、翻白草大、中

4、、小劑量組、丹參大、中、小劑量組和生地大、中、小劑量組，每組7只．造模結(jié)束后改為普通飲食，分別予以相應(yīng)藥物進(jìn)行治療，連續(xù)4周。 (2)分剮子治療開(kāi)始前、治療結(jié)束后稱(chēng)量體重． (3)分別于治療開(kāi)始前、治療結(jié)束后，采末梢血，使用羅氏優(yōu)越血糖儀檢測(cè)血糖。 (4)分別于開(kāi)始治療前、治療結(jié)束后，采靜脈血，采用放射免疫分析法檢測(cè)血清胰島素。 (5)分別于治療開(kāi)始前、治療結(jié)束后，采靜脈血，采用硝酸還原酶法檢測(cè)血清一氧化

5、氮(NO)． (6)分別于治療開(kāi)始前，治療結(jié)束后，采用放射免疫分析法檢測(cè)血清內(nèi)皮素(ET)． (7)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死大鼠，取腹主動(dòng)脈，制作超薄切片，醋酸鈾一枸櫞酸鉛雙重染色，電鏡觀(guān)察腹主動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)。 (8)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死大鼠，取腹壁肌，制作超薄切片，醋酸鈾一枸櫞酸鉛雙重染色，電鏡觀(guān)察骨骼肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。 (9)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死大鼠，取腹壁肌，采用蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳、免疫印跡法等方法，檢測(cè)骨骼肌

6、細(xì)胞磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)、磷酸肌醇依賴(lài)性蛋白激酶1(PDKI)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GluT4)蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： (1)理論研究：中醫(yī)歷代先賢諸家的論述明確指出消渴之為病，不論何種原因、在何病位，皆由熱火內(nèi)盛、怫郁結(jié)滯，耗傷陰津，導(dǎo)致津液虧損所致；消渴并發(fā)癥的發(fā)生亦與燥熱熾盛有關(guān)，如消渴并發(fā)癰疽便是熱火熾盛之明證．而“毒者，邪氣蘊(yùn)結(jié)不解之謂”，“邪盛謂之毒”，熱火熾盛、蘊(yùn)結(jié)持久而為熱毒．故而認(rèn)為熱毒是促使DM

7、發(fā)生發(fā)展和產(chǎn)生并發(fā)癥的基本致病因素和重要病理機(jī)制。另外，清熱解毒法治療DM得到了臨床的驗(yàn)證，確有療效，也反證了熱毒在DM病因病機(jī)中的地位。 (2)清熱解毒與滋陰清熱、活血化瘀對(duì)T2DM大鼠糖代謝的影響：翻白草大、中劑量組、丹參大、中劑量組和生地大、中、小劑量組大鼠體重顯著增加(P<0.01)；翻白草小劑量組、丹參小劑量組體重明顯增加(P<0.05)；翻白草中劑量組體重增幅高于生地中劑量組，但兩者比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；翻白草中劑量組體

8、重增幅顯著高于丹參中劑量組(P<0.01)，生地中劑量組體重增幅明顯高于丹參中劑量組(P<0.05)。 翻白草大劑量組血糖治療前后相比明顯降低(P<0.05)；翻白草中、小劑量組血糖治療前后相比均顯著降低(P<0.01)．丹參大、中、小劑量組血糖治療前后相比均有所降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)．生地大、中劑量組血糖治療前后相比均有顯著降低(P<0.01)；生地小劑量組血糖治療前后相比明顯降低(P<0.05)；翻白草中劑量組

9、血糖降幅大于生地中劑量組，但兩者比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；翻白草、生地中劑量組血糖降幅顯著大于丹參中劑量組(P<0.01)。 翻白草大、中、小劑量組血清INs治療前后相比顯著升高(P<0.01)．丹參大、中、小劑量組血清INs治療前后相比顯著降低(P<0.01)；生地大劑量組血清INs治療前后相比顯著升高(P<0.01)；生地中、小劑量組血清INS治療前后相比明顯升高(P<0.05)；翻白草中劑量組血清INS增幅高于生地

10、中劑量組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義《P>0.05)。 (3)清熱解毒與滋陰清熱、活血化瘀對(duì)T2DM大鼠血管活性因子的影響：翻白草大、中劑量組大鼠血清NO治療前后顯著降低(P<0.01)，小劑量組明顯降低(P<0.05)；丹參大劑量組大鼠血清NO治療前后顯著降低(P<0.01)，中、小劑量組明顯降低(P<0.05)；生地大、中劑量組大鼠血清NO治療前后顯著降低(P<0.01)，小劑量組明顯降低(P<0.05)；丹參各劑量組NO降幅最大，生地

11、相應(yīng)劑量組次之，翻白草相應(yīng)劑量組再次之，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(以中劑量組比較)(P>0.05)；三者的各劑量組中，均以大劑量組效果為最好，中劑量組次之，小荊量組再次之，但三者的各劑量組之間比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 翻白草、丹參、生地各劑量組大鼠血清ET治療前后均顯著降低(P<0.01)；翻白草各劑量組大鼠血清ET降幅均大于生地各相應(yīng)劑量組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>O.05)；翻白草、生地各劑量組大鼠血清ET降幅均顯著大于丹參各

12、相應(yīng)劑量組(P<0.1)；三者各劑量組中均以大劑量組ET降幅最大、中劑量組次之、小劑量組再次之，三者各劑量組中的大劑量組ET降幅均顯著大于小劑量組(P<0.01)，余皆無(wú)差異(P>0.05)。 (4)清熱解毒與滋陰清熱、活血化瘀對(duì)T2DM大鼠腹主動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)的影響：模型組腹主動(dòng)脈血管內(nèi)發(fā)細(xì)胞(VEC)結(jié)構(gòu)受損較重，通透性增高，細(xì)胞腫脹、脫落；血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖并向內(nèi)膜遷移，膠原纖維增生、管壁硬化，線(xiàn)粒體腫脹。格列奇特

13、組、翻白草各劑量組、丹參各劑量組、生地各劑量組腹主動(dòng)脈VEC、VSMC的損傷有不同程度減輕；其中翻白草、丹參、生地各劑量組中均以大劑量效果最好、中劑量次之、大劑量再次之；翻白草、生地各相應(yīng)劑量組效果基本相當(dāng)，而均優(yōu)于丹參各相應(yīng)劑量組。 (5)清熱解毒與滋陰清熱、活血化瘀對(duì)T2DM大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的影響：T2DM模型組大鼠骨骼肌組織結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為肌原纖維排列紊亂、斷裂；肌節(jié)結(jié)構(gòu)不完整且模糊；線(xiàn)粒體體積增大，部分線(xiàn)粒體明

14、顯腫脹、電子密度低，線(xiàn)粒體嵴排列紊亂或中斷或腫脹；糖原顆粒顯著增多，有較多脂滴；間質(zhì)內(nèi)有明顯的膠原纖維增生。翻白草各劑量組、丹參各劑量組，生地各劑量組大鼠骨骼肌組織損傷均較模型組有不同程度的減輕，且均以大劑量組效果最好、中劑量組次之、小劑量組損傷再次之；其中翻白草與生地的相應(yīng)劑量組的效果基本相當(dāng)，而優(yōu)于丹參的相應(yīng)劑量組。 結(jié)論： (1)熱毒是促使DM發(fā)生發(fā)展和產(chǎn)生并發(fā)癥的基本致病因素和重要病理機(jī)制． (2)清熱解

15、毒與滋陰清熱均能有效降低T2DM大鼠血糖，兩者作用效果基本相當(dāng)，但清熱解毒略?xún)?yōu)于滋陰清熱；活血化瘀則不能有效降低血糖。翻白革降血糖作用的機(jī)理可能是： ①保護(hù)胰島B細(xì)胞，促進(jìn)INS分泌； ②上調(diào)胰島素敏感組織骨骼肌細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，增加血糖向骨骼肌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移。 生地降血糖作用的機(jī)理可能是： ①促進(jìn)INs分泌； ②上調(diào)胰島素敏感組織骨骼肌細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，增加血糖向骨骼肌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移．丹參不能有效促

16、進(jìn)INs分泌，亦不能上調(diào)骨骼肌細(xì)胞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而不能有效控制DM大鼠血糖． (3)清熱解毒與滋陰清熱、活血化瘀均能有效降低T2DM大鼠VEC損傷，減少VSMC增生，從而達(dá)到防治糖尿病大血管病交的目的。清熱解毒、滋陰清熱的作用效果相當(dāng)，但清熱解毒略?xún)?yōu)于滋陰清熱；兩者均優(yōu)于活血化瘀。翻白草、生地防治大血管病變的作用機(jī)理可能是： ①有效地降低血糖，減少高血糖毒性對(duì)VEC、VSMC的損害； ②降低VEC分泌ET，減

17、少ET對(duì)VEC、VSMC的損害； ③下調(diào)NO的生成，降低高濃度NO的細(xì)胞毒性作用． 丹參防治大血管病變的作用機(jī)理可能是： ①降低VEC分泌ET，減少ET對(duì)VEC、VSMC的損害； ②下調(diào)NO的生成，降低高濃度NO的細(xì)胞毒性作用． (4)清熱解毒與滋陰清熱、活血化瘀均能有效保護(hù)骨骼肌組織，減輕骨骼肌組織損傷。清熱解毒與滋陰清熱的效果相當(dāng)，但清熱解毒略?xún)?yōu)于滋陰清熱；兩者均優(yōu)于活血化瘀。翻白草、生地防治