β腎上腺素受體信號對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠樹突細胞及成纖維樣滑膜細胞的影響.pdf

1、腎上腺素受體(AR)作為神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵受體,可能參與了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的發(fā)生、發(fā)展過程。樹突細胞(DCs)作為功能強大的抗原提呈細胞,在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)中起重要作用,可能在以下幾個方面參與RA的發(fā)病機制:DCs能激活淋巴器官中MHC限制性自身免疫反應(yīng),誘導(dǎo)免疫應(yīng)答;DCs浸潤至滑膜和滑液中,關(guān)節(jié)局部內(nèi)攝取、處理、提呈抗原,促使 RA遷延持續(xù);DCs、滑膜細胞、巨噬細胞一起產(chǎn)生炎性介質(zhì),進一步刺激產(chǎn)生RA的炎癥免疫反應(yīng)等。成纖維樣

2、滑膜細胞(FLS)是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的主要效應(yīng)細胞,其異常增殖,同時自身分泌的IL-1β、TNF-α和RANKL等炎性細胞因子加劇了局部的炎癥反應(yīng)。DCs和FLS均有AR的表達,均可能參與對RA的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié),尤其是β-AR信號可能具有炎癥免疫調(diào)節(jié)的作用。本課題采用佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠模型,運用流式細胞術(shù)、QRT-PCR、免疫熒光、免疫印跡等方法,通過觀察β-AR激動藥(ISO)對DCs和FLS功能的影響,探討β-AR及其信號對DCs和

3、FLS功能的調(diào)節(jié)作用,進一步研究該信號通路在AA大鼠DCs和FLS中的異常變化及部分機制,為揭示β-AR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與RA異常炎癥免疫反應(yīng)的病理機制提供實驗依據(jù)。
　　目的:觀察β-AR信號對大鼠DCs和FLS功能的調(diào)節(jié)作用,探討AA大鼠DCs和FLS上β-AR信號的變化及對其功能的影響,為揭示β-AR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與RA異常炎癥免疫反應(yīng)的病理機制以及藥物作用新靶點提供重要依據(jù)。
　　方法:
　　采用rIL-4、rGM-CS

4、F刺激大鼠骨髓源細胞,誘導(dǎo)生成DCs;流式細胞術(shù)檢測DCs表型CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表達和抗原攝取功能,FLS表面β2-AR的表達采用FITC標記的二抗間標法檢測,均以平均熒光強度表示表達的高低;MTT法檢測FLS的增殖及混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)中T細胞的增殖;ELISA法檢測IL-1β、IL-10、TNF-α、RANKL、OPG和cAMP的水平;采用完全弗氏佐劑于大鼠足趾注射制得AA模型,β2-AR激動藥灌胃給予,使用足爪

5、儀測足爪容積計算足爪腫脹度,HE染色觀察關(guān)節(jié)病理,胸腺、脾臟重量與體重的比值表示胸腺、脾臟指數(shù);免疫組化法檢測β2-AR在DCs和FLS上的分布;免疫熒光法檢測β2-AR在FLS上的表達情況;Western blot法檢測β2-AR、GRK2、β-arrestin2的膜表達和p-ERK的表達;QRT-PCR法檢測β2-AR mRNA、GRK2 mRNA的表達。
　　結(jié)果:
　　1.β-AR信號對AA大鼠DCs功能的影響

6、>　　β-AR激動藥ISO能明顯下調(diào)CD86、MHC-Ⅱ的表達,對CD80表達無明顯影響;ISO能明顯提高DCs的抗原攝取功能,升高IL-10的水平,抑制MLR。ISO主要通過β1-AR信號下調(diào)CD86的表達,通過β2-AR信號影響MHC-Ⅱ的表達、影響抗原的攝取功能、產(chǎn)生對MLR的影響。β2-AR激動藥沙丁胺醇體內(nèi)給藥能顯著下調(diào)AA大鼠腸系膜淋巴結(jié)DCs和骨髓源DCs表面MHC-II的表達,提高DCs的吞噬能力,但對CD80、CD86

7、的表達無明顯影響,與體外實驗結(jié)果一致;β2-AR激動藥沙丁胺醇能明顯降低AA大鼠足爪腫脹度,不同程度的改善關(guān)節(jié)的異常病理;能顯著降低AA大鼠的胸腺、脾臟指數(shù),抑制T淋巴細胞,但對B淋巴細胞增殖反應(yīng)無明顯影響。
　　ISO處理后的AA模型組骨髓源DCs對T細胞增殖的抑制作用明顯低于正常組,Western blot法檢測AA模型組大鼠骨髓源DCs胞膜中β2-AR表達明顯下降。AA病程中研究發(fā)現(xiàn),致炎后d21、d28,β2-AR的膜表達

8、顯著降低,GRK2的膜表達顯著升高;基因水平顯示,β2-AR mRNA、GRK2 mRNA無顯著變化。
　　2.β-AR信號對AA大鼠FLS功能的影響
　　ISO能明顯抑制FLS的增殖,抑制FLS分泌IL-1β、TNF-α和RANKL的水平,促進OPG的分泌水平,其抑制增殖作用主要通過β2-AR信號發(fā)揮。β2-AR激動藥沙丁胺醇體內(nèi)給藥能抑制FLS的增殖反應(yīng)。
　　β2-AR在AA大鼠FLS胞膜的表達顯著下降,ISO對

9、其增殖的抑制作用明顯降低,刺激后β2-AR的脫敏作用明顯高于正常對照組。AA大鼠FLS胞膜中GRK2、β-arrestin2的表達顯著升高。AA模型組cAMP水平明顯降低,經(jīng)ISO刺激后對照組和AA模型組cAMP水平均顯著升高,但AA模型組cAMP水平顯著低于對照組。AA模型組p-ERK水平顯著增高,經(jīng)ISO刺激,AA模型組p-ERK水平顯著高于對照組;與未刺激組相比,ISO能顯著升高AA模型組FLS p-ERK的水平,對對照組無明顯影

10、響。
　　結(jié)論:
　　1.β2-AR信號參與了對DCs和FLS功能的調(diào)節(jié)。
　　(1)β2-AR信號促進DCs的抗原攝取,抑制其抗原的提呈功能。(2)β2-AR信號的激活可以抑制FLS增殖。
　　2.β2-AR信號在AA大鼠DCs和FLS中的異常改變是其對激動藥反應(yīng)存在差異的原因。
　　(1)AA大鼠DCs和FLS中β2-AR膜表達下降是其對激動藥反應(yīng)減弱的重要原因。(2)AA大鼠GRK2、β-arrest