攜抗ICAM-1單抗和抗CD34單抗雙靶向超聲造影劑的制備及體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分?jǐn)y抗ICAM-1單抗和抗CD34單抗雙靶向超聲造影劑的制備及體外顯影實(shí)驗(yàn)
　　 目的:制備同時(shí)攜抗ICAM-1單抗和CD34單抗的雙靶向超聲造影劑，鑒定其基本性質(zhì)并進(jìn)行體外顯影實(shí)驗(yàn)。
　　 方法:采用“生物素-親和素”橋接法分別構(gòu)建攜抗ICAM-1單抗和CD34單抗的雙靶向造影劑（MBD）、攜抗ICAM-1單抗(MB ICAM-1)和CD34單抗(MB CD34)的3種靶向造影劑。光學(xué)顯微鏡下觀察靶向微泡造影劑的

2、形狀，馬爾文激光粒度分析儀、激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀檢測靶向微泡的基本特性和抗體結(jié)合率，DFY超聲圖像定量分析儀分析超聲造影劑的回聲強(qiáng)度。
　　 結(jié)果:3種靶向微泡造影劑的形狀、粒徑、表面電位及抗體結(jié)合率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，激光共聚焦顯微鏡下觀察抗體成功的鏈接到造影劑表面，DFY超聲圖像定量分析儀結(jié)果:MBD的回聲強(qiáng)度高于MBICAM-1、MBCD34和普通生物素化微泡(MBBiotin)。
　　 結(jié)論:成功的制備了攜抗

3、ICAM-1單抗和CD34單抗雙靶向超聲造影劑。
　　 第二部分?jǐn)y抗ICAM-1單抗和抗CD34單抗雙靶向超聲造影劑的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　 第一節(jié)體外分離、培養(yǎng)大鼠骨源性內(nèi)皮祖細(xì)胞及鑒定
　　 目的:體外分離、誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)，并進(jìn)行基本特性鑒定。
　　 方法:密度梯度離心法收集到的大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，接種到纖維黏連蛋白預(yù)先鋪被好的培養(yǎng)瓶中，添加特殊培養(yǎng)基EGM-2MV對EPC

4、s進(jìn)行誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，通過細(xì)胞免疫熒光檢測:CD34、CD133、VEGFR-2表達(dá)情況，及攝取DiI-acLDL和結(jié)合FITC-UEA-1雙熒光染色對其進(jìn)行鑒定，用MTT法及細(xì)胞移行實(shí)驗(yàn)檢測EPCs生長情況及遷移能力。
　　 結(jié)果:新分離的骨髓單個(gè)核細(xì)胞呈圓形，大小不一;貼壁細(xì)胞CD34、CD133、VEGFR-2的表達(dá)均成陽性，7d后的細(xì)胞能攝取DiI-acLDL和結(jié)合FITC-UEA-1，細(xì)胞移

5、行實(shí)驗(yàn)可見平均每個(gè)視野細(xì)胞移行數(shù)(16.6±1.05)個(gè)。
　　 結(jié)論:通過密度梯度離心法，在EGM-2MV培養(yǎng)體系下，能較好的培養(yǎng)并擴(kuò)增出內(nèi)皮祖細(xì)胞。
　　 第二節(jié)攜抗ICAM-1單抗和抗CD34單抗雙靶向超聲造影劑的體外靶向?qū)嶒?yàn)
　　 目的:探討攜抗ICAM-1單抗和抗CD34單抗雙靶向超聲造影劑的體外靶向能力。
　　 方法:通過“生物素-親和素”法構(gòu)建攜抗ICAM-1單抗和CD34單抗的雙靶向微泡造

6、影劑(MBD)、攜抗ICAM-1單抗(MBICAM-I)和CD34單抗(MB CD34)的3種靶向造影劑:用細(xì)胞免疫熒光法鑒定，重組人壞死因子-α(TNF-α)刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞建立的內(nèi)皮損傷模型;倒置顯微鏡下觀察雙靶向微泡與內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)和損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的結(jié)合情況。
　　 結(jié)果:激光共聚焦顯微鏡下見:經(jīng)TNF-α刺激后HUVECs胞漿內(nèi)見大量綠色熒光，說明經(jīng)刺激后的細(xì)胞ICAM-1表達(dá)增多;倒置