縫隙連接及連接蛋白43在胰島素調節(jié)大鼠血管平滑肌細胞收縮反應性中的變化機制及藥物干預研究.pdf

1、研究背景:
　　冠狀動脈痙攣是急性冠脈綜合癥、變異型心絞痛、冠狀動脈微血管性心絞痛以及危及生命心律失常等多種心血管疾病的重要病因，并且急性心梗病人中激發(fā)性冠狀動脈痙攣的發(fā)生是其預后不良的預測因子[1]。即使在現(xiàn)今因鈣拮抗劑廣泛使用并且可能引起冠狀動脈痙攣的發(fā)生率逐漸降低的西方國家，對于急性胸痛的相對年輕患者仍應高度警惕痙攣性心絞痛的發(fā)生[2]。2008年公布的CASPAR試驗結果表明超過四分之一的冠脈痙攣患者沒有明顯的冠脈血管阻塞

2、，其中約百分之五十的患者存在明確的冠狀動脈痙攣[3]。從Egashira[4][5]等發(fā)現(xiàn)在冠狀動脈痙攣部位并未發(fā)現(xiàn)NO的減少，從而推測存在其他機制如磷脂酶C活性增高引起血管平滑肌細胞的高反應性而誘發(fā)變異型心絞痛的發(fā)生，人們對冠狀動脈痙攣的機制研究逐漸從內皮功能不全轉移到血管平滑肌細胞高反應性及其他[6]。
　　血管平滑肌細胞是調整血管張力的最終效應器官，血管平滑肌反應性大小與自身細胞間傳遞及依賴內皮調節(jié)有關。但血管壁平滑肌細胞間

3、如何協(xié)同反應仍未完全明確?？p隙連接(gap junction，GJ)是存在于相鄰細胞間的一種膜通道結構，作為一種直接通訊參與了細胞間的物質和信息的交流，存在于內皮細胞間、內皮和血管平滑肌細胞間以及血管平滑肌細胞間，對維持血管張力有重要作用。GJ的基本組成單位是是連接蛋白(Connexin，Cx)。在血管平滑肌系統(tǒng)以表達Cx43、Cx40、Cx37、Cx45為主，尤其在大的彈性動脈中層以表達Cx43為主，而在肌性動脈則以Cx40、Cx37

4、、Cx45為主[7][8]。當機體受到高血壓、動脈粥樣硬化、缺血缺氧等所致細胞損傷或增生后，通過改變連接蛋白的表達，可以明顯改變縫隙連接的功能，對血管壁的細胞間交流進行精細調節(jié)從而影響血管的舒縮功能，使機體對不同刺激做出及時、有效地應答，因此可能參與血管痙攣性疾病的發(fā)生[9][10]。Cx43似乎是機械變化的早期感受器，平滑肌細胞通過Cx43對增加的跨膜壓作出相應的彈性和收縮性改變。研究表明Cx43的磷酸化與去磷酸化對縫隙連接通道功能有

5、非常重要的影響。
　　胰島素抵抗作為代謝綜合癥的中心環(huán)節(jié)，貫穿糖尿病發(fā)生發(fā)展的整個過程，在此過程中先出現(xiàn)高胰島素血癥等炎癥性、氧化應激性改變之后逐漸出現(xiàn)高血壓、高血糖等相關性疾病(11)(12)。有研究表明胰島素抵抗伴有高胰島素血癥是冠狀動脈痙攣的獨立危險因素[13]。冠狀動脈痙攣的發(fā)生與內皮功能不全、血管平滑肌反應性增高、氧化應激、離子失衡等有關。而IR作為一種致炎狀態(tài)，與內皮功能損害、血管反應性、氧化應激等同樣密切相關。但有研

6、究表明胰島素可以緩解冠狀動脈痙攣并增加血流而改善血管痙攣患者的心絞痛癥狀。而高胰島素水平又能促使內皮細胞產(chǎn)生ET-1而加重血管痙攣。不同濃度的胰島素對彈力血管的舒縮功能改變產(chǎn)生的作用不同，而且在胰島素抵抗狀態(tài)下不同部位的血管反應性也發(fā)生不同變化[14][15]。究竟是什么原因導致這種病理生理差異性的改變，目前尚未知曉。研究顯示氧化磷脂OxPAPC能夠改變血管內皮細胞、平滑肌細胞中Cx37、Cx43的表達，與其增加Cx43T265位點磷酸

7、化有關，并降低肌內皮縫隙連接功能，推測可能與高血脂、高血壓及代謝綜合征等引起的血管功能改變有關[16]。而RhoA-ROCK通路作為血管收縮的一個分子開關其激活與高血壓、糖尿病及衰老狀態(tài)下活性氧介導的血管平滑肌收縮功能改變有關[17]。目前氧化應激是否通過RhoA-ROCK通路對胰島素抵抗狀態(tài)下血管平滑肌細胞中縫隙連接蛋白的表達及縫隙連接間通訊交流產(chǎn)生影響的相關報道較少。
　　本課題組先期研究顯示通心絡通過多種途徑可以抑制冠狀動脈

8、痙攣。其作用機制可能為抑制PKC活性，減少氧化應激的產(chǎn)生，促進NO的產(chǎn)生，減少抗氧化物質的消耗，抑制ET-1所致的病理狀態(tài);抑制Rho激酶表達、活性的增加從而持續(xù)有效的抑制血管痙攣的作用[18]）。通心絡能否影響胰島素抵抗引起血管損傷時的異?？p隙連接蛋白表達從而改變細胞間通訊交流未見報道。同時阿托伐他汀鈣能夠降低血管平滑肌細胞中Cx43的表達而抑制細胞增殖，但對慢性高濃度胰島素培養(yǎng)下VSMCs中Cx43及磷酸化的影響尚未見報道，其中具體

9、機制仍需進一步探求。
　　本課題分別應用不同濃度胰島素、高糖與高胰島素與大鼠主動脈平滑肌細胞共培養(yǎng)，并應用高濃度胰島素予急性刺激，運用蛋白印記技術和共聚焦顯微鏡，分析縫隙連接及連接蛋白的表達變化并觀察血管平滑肌細胞對5-HT的收縮反應性;觀察平滑肌細胞內H2O2對縫隙連接及連接蛋白的影響及可能作用通路;研究他汀類藥物及通心絡醇提物改變縫隙連接及連接蛋白表達的可能機制，旨在闡明胰島素對縫隙連接及連接蛋白參與血管平滑肌細胞收縮反應性的

10、機制，開創(chuàng)防治冠脈痙攣藥物作用新靶點，具有重要的理論和臨床意義。
　　研究方法:
　　1、模擬不同胰島素環(huán)境培養(yǎng)血管平滑肌細胞觀察縫隙連接及連接蛋白43并磷酸化位點S368的變化。培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞，取3-5代細胞分別在正常葡萄糖組、生理濃度胰島素組、高濃度胰島素組、高濃度胰島素+高葡萄糖組培養(yǎng)24小時，之后予急性高濃度胰島素刺激30分鐘。采用共聚焦熒光顯微鏡觀察5-HT作用下血管平滑肌細胞形態(tài)、鈣濃度變化，熒光漂白恢復

11、試驗測定縫隙連接功能，western blot測定Cx43及Cx43-S368蛋白表達。
　　2、高胰島素環(huán)境培養(yǎng)血管平滑肌細胞分析活性氧簇清除劑catalase、ROCK阻斷劑Y-27632對縫隙連接及連接蛋白的影響，并探討其中的關聯(lián)。培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞，取3-5代細胞分別在予catalase、Y-27632及二者共預處理后再分別與高濃度胰島素共培養(yǎng)30min或24小時。采用共聚焦熒光顯微鏡觀察5-HT作用下熒光漂白恢復試驗

12、測定縫隙連接功能，western blot測定Cx43及P-Cx43-S368蛋白表達?；瘜W發(fā)光法及G-lisa法測定H2O2水平和RhoA活性變化。
　　3、慢性高胰島素培養(yǎng)血管平滑肌細胞，分析阿托伐他汀鈣、通心絡醇提物對縫隙連接及Cx43及P-Cx43-S368的影響，同時測定H2O2、 RhoA活性變化，探討阿托伐他汀鈣及通心絡的可能作用機制。
　　研究結果:
　　1、不同胰島素環(huán)境與血管平滑肌細胞共培養(yǎng)24小時

13、:①1nm/l、l00nm/l胰島素及100nm/l胰島素+25mmol/l葡萄糖處理細胞，激光共聚焦顯微鏡下觀察VSMCs在5-羥色胺作用下收縮情況:A:細胞形態(tài)面積:生理濃度胰島素組細胞縮小變化百分率（5.72±0.14）、急性胰島素作用VSMCs面積縮小率(5.59±0.89)小于高胰島素組（13.89±0.98）及高胰島素+高糖組（14.78±1.02），P＜0.05，有統(tǒng)計學意義。B:Ca2+內流:生理胰島素組鈣熒光強度增加受

14、抑制，而高胰島素組及高胰島素+高糖組增加，P＜0.05有統(tǒng)計學意義;急性高濃度胰島素作用VSMCs，鈣熒光強度增加但低于慢性胰島素作用組，P＜0.05有統(tǒng)計學意義;②激光共聚焦顯微鏡下測定FRAP:在高胰島素作用下最大熒光恢復比例、熒光恢復速率低于對照組和生理胰島素組，P＜0.05，有統(tǒng)計學差異;在5-HT作用下，對照組、生理胰島素組、急性高胰島素組GJIC增加不顯著或降低，而高胰島素組及高胰島素+高糖組明顯增加，有統(tǒng)計學差異;③wes

15、tern檢測Cx43及P-Cx43-S368蛋白表達:在胰島素作用下各組均有P-Cx43-S368表達，隨著濃度增加及時間延長而增加;急性胰島素作用VSMCs，Cx43表達降低，而隨著作用時間逐漸延長至24小時，Cx43表達增加;慢性胰島素孵育VSMCs后再予急性胰島素刺激，P-Cx43-S368表達繼續(xù)增加，而Cx43增加不顯著，與慢性組比較，前者有統(tǒng)計學意義，后者無統(tǒng)計學差異。
　　2、高胰島素與VSMCs長時間共培養(yǎng)前經(jīng)ca

16、talase(2000u/ml)、Y-27632(10umol/l)預處理30min后:①FRAP檢測受抑制的GJIC恢復，與處理組比較有統(tǒng)計學差異;在5-HT作用下，GJIC增加不顯著，較control組無統(tǒng)計學差異;western檢測Cx43及P-Cx43-S368蛋白表達均明顯降低，與胰島素處理組比較有統(tǒng)計學差異;②G-lisa檢測高胰島素處理細胞24h后，細胞RhoA活性增高，較control組有統(tǒng)計學差異;預處理后RhoA活性

17、下降，與處理組比較有統(tǒng)計學差異;③H2O2檢測試劑盒檢測100nmol/l insulin處理細胞24h后H2O2水平，與control組比較，H2O2增加有統(tǒng)計學意義(108.1±8.9 VS18.6±4.2，P＜0.01);預處理后H2O2水平下降，較處理組比較有統(tǒng)計學意義。高胰島素與VSMC短時間共培養(yǎng)前經(jīng)catalase(2000u/ml)、Y-27632(10umol/l)預處理后:①FRAP檢測受抑制的GJIC恢復，與處理組

18、比較有統(tǒng)計學差異;在5-HT作用下，GJIC抑制不顯著，較control組無統(tǒng)計學差異;western檢測P-Cx43-S368表達明顯降低，與處理組比較有統(tǒng)計學差異;而Cx43表達恢復較comtrol組無差異;②G-lisa檢測高胰島素處理細胞30min后，細胞RhoA活性降低，較control組有統(tǒng)計學差異;catalase預處理后RhoA活性較control組無統(tǒng)計學差異;③H2O2檢測試劑盒檢測100nmol/l inslin處

19、理細胞30min后H2O2水平，與control比較，H2O2增加有統(tǒng)計學意義(48.1±7.4VS18.4±3.2，P＜0.01)，預處理后H2O2水平降低，與對照組比較無統(tǒng)計學差異。
　　3、高胰島素與VSMC長時間共培養(yǎng)前經(jīng)atrovastatin(10umol/l)、通心絡醇提物(5mg/ml)預處理20min后:①FRAP檢測抑制的GJIC恢復，與胰島素處理組比較有統(tǒng)計學差異;western檢測Cx43及P-Cx43-S

20、368蛋白表達均明顯降低，與處理組比較，有統(tǒng)計學差異;②G-lisa檢測細胞RhoA活性降低，較胰島素處理組有統(tǒng)計學差異;③H2O2檢測試劑盒檢測H2O2水平，與胰島素處理組比較，H2O2降低有統(tǒng)計學意義(atrovastatin組50.5±4.8VS108.1±8.9，P＜0.01;TXL組58.1±10.2VS108.1±8.9，P＜0.01);atrovastatin組與GGPP共孵育后atrovastatin作用均被逆轉。

21、>　　結論:
　　1、高濃度胰島素影響大鼠血管平滑肌細胞縫隙連接通訊對5-羥色胺反應性和縫隙連接蛋白43表達，其變化呈雙相特征，即高濃度胰島素短時間處理細胞，GJIC反應性及Cx43下調，長時間處理細胞則反之;
　　2、胰島素可引起縫隙連接蛋白S368位點磷酸化。
　　3、高濃度胰島素通過H2O2調節(jié)血管平滑肌細胞RhoA活性，其調節(jié)具有雙相特征;即高濃度胰島素短時間處理細胞下調RhoA活性，長時間處理細胞則反之;并影

22、響縫隙連接通訊對5-羥色胺反應性和縫隙連接蛋白43表達;
　　4、阿托伐他汀鈣通過異戊二烯途徑抑制慢性高濃度胰島素誘導的血管平滑肌細胞Cx43及P-Cx43-S368高表達，恢復異常GJIC，是其心血管保護作用的多效性又一體現(xiàn);通心絡醇提物具有同樣作用，可能與其抗氧化、抑制RhoA活性有關;
　　5、生理濃度胰島素及急性高濃度胰島素抑制血管平滑肌細胞GJIC對5-HT高反應性，是其生物學效應，是氧化應激的保護作用;而慢性高濃