腦缺血藥物篩選細(xì)胞模型的構(gòu)建及應(yīng)用研究.pdf

1、缺血性腦血管病是因腦部供血障礙所引起的腦組織相應(yīng)區(qū)域缺血及缺氧而造成腦組織的破壞，從而出現(xiàn)一系列生化代謝異常、生理功能喪失的疾病，是世界范圍內(nèi)死亡和長期殘疾的主要原因。腦缺血的有效治療主要涉及機體適應(yīng)缺氧觖血、血管新生及神經(jīng)元的保護/再生等方面。
　　低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factors，HIF)是細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)錄水平協(xié)調(diào)氧變化的最主要的調(diào)節(jié)因子，是一種介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)低氧反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，促進其激活有利于缺

2、血性疾病的治療。通過HIF-1α上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達可在腦和心臟中誘導(dǎo)目標(biāo)區(qū)域形成新的血管，從而增加血流量和氧供應(yīng)并減輕缺血的不良反應(yīng)。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，是內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial cells，ECs)特異性促有絲分裂原，也是作用最強，特異性最高的促血管生長因子。發(fā)生腦缺血后，VEGF是血管生成、神經(jīng)保護和神經(jīng)再生過程中最重要的

3、生長因子。它能夠顯著提高缺血腦部的血管生成，并減少恢復(fù)過程中的神經(jīng)功能損傷。神經(jīng)生長因子(Nervegrowth factor, NGF)，是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的典型成員，具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突觸生長雙重生物學(xué)功能，對中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調(diào)控作用。NGF除了神經(jīng)保護以外還可通過促進血管再生改善缺血性疾病。因此以HIF1α，VEGF和NGF為靶點篩選腦缺血治療藥物，不僅有助于抗腦缺血藥物的開發(fā)，

4、也為藥物抗腦缺血作用機制研究提供一定的前期基礎(chǔ)。
　　本研究構(gòu)建了以HIF1α，VEGF，NGF啟動子為作用靶點的細(xì)胞篩選模型，可用于高效、分類篩選具有抗腦缺血功效的藥物成分。首先，用HIF1α, VEGF和NGF基因的啟動子序列（其中，HIF1α選取了兩個序列）分別調(diào)控報告分子紅色熒光蛋白(E2-Crimson,E2)或熒光素酶(Luciferase，Luc)基因的轉(zhuǎn)錄，以此構(gòu)建了8個重組質(zhì)粒:pHp1-E2，pHp2-E2,p

5、Vp-E2,pNp-E2; pHp1-Luc,pHp2-Luc,pVp-Luc,pNp-Luc,其中，Hp,Vp和Np分別表示HIF1α promoter, VEGF promoter和NGF promoter。隨后，用這8個質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，建立了24株穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞株（每個質(zhì)粒建立3株細(xì)胞），分別命名為293-pHp1-E2a,b，c，293-pHp2-E2a,b，c，293-pVp-E2a,b，c，293-pNp-E

6、2a,b,c;293-pHp1-Luca,b,c，293-pHp2-Luca,b，c，293-pVp-Luca,b，c和293-pNp-Luca,b，c。再利用二氯化鈷、脂多糖、鹽酸克倫特羅等陽性刺激物分別對含HIF1α，VEGF，NGF啟動子序列的3類細(xì)胞株進行功能驗證，建立以HIF1α，VEGF, NGF啟動子為作用靶點的3類藥物篩選的細(xì)胞模型:293-pHp1-Luc，293-pHp2-Luc，293-pVp-Luc和293-pN